共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:1采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,2应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为33.4798±2.0929、47.974±5.1628、47.0861±2.2033、7.4642±0.6791(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响(R68)

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为7.410±1.738、8.844±1.981、22.4272±2.058、2.445±0.2517(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。

人破骨细胞分化中重组结核杆菌热休克蛋白10的影响

背景:体外小鼠颅盖骨实验已证实了其结核杆菌热休克蛋白10的破骨效应。目的:在诱导破骨细胞分化的体外细胞培养系统中,研究重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞分化的影响及相关机制。方法:选用人巨噬细胞集落刺激因子依赖性附着性血液单个核细胞,实验分为:核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组、核因子κB受体活化因子配体组、重组结核杆菌热休克蛋白10组(1 mg/L)、阴性对照组(完全培养基),核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组、重组结核杆菌热休克蛋白10组中重组结核杆菌热休克蛋白10质量浓度为1 mg/L,在含有巨噬细胞集落刺激因子的a-MEM培养液重悬单核细胞,各组培养7,14,21 d后,观察所形成的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色多核细胞的形态、数目、骨吸收面积;各组NFATc1、c-Fos基因及蛋白表达情况。结果与结论:阴性对照组无抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞分化生成,其余各组均有抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞分化生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;重组结核杆菌热休克蛋白10组形成的破骨细胞分化细胞数目、吸收陷窝数目及陷窝面积显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组;阴性对照组NFATc1、c-Fos基因表达水平显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组和重组结核杆菌热休克蛋白10组,而重组结核杆菌热休克蛋白10组表达NFATc1、c-Fos蛋白,显著低于核因子κB受体活化因子配体+重组结核杆菌热休克蛋白10组。提示结核杆菌热休克蛋白10参与破骨细胞分化的形成,可能与诱导相关基因NFATc1、c-Fos表达上调有关。

结核杆菌热休克蛋白70在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

为获得结核杆菌热休克蛋白 70在毕赤酵母中的分泌表达。构建了酵母表达质粒pPIC9K hsp70 ,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiapastorisGS115 ,经PCR方法筛选出阳性菌落 ,在 0 .5 %甲醇诱导下分泌表达。所得产物经离心收集上清、超滤浓缩脱盐、亲和层析后 ,分别用SDS PAGE、Westernblot和动物免疫实验对上清中的重组Hsp70进行鉴定 ,并考察产物对DC的作用。经SDS PAGE、Westernblot分析表明表达的Hsp70表观分子量为 70kD并能特异性地与抗 Mt.Hsp70单抗结合 ,动物实验表明重组的Hsp70能在体诱导免疫应答。重组Hsp70能够诱导DC成熟并释放Th1型细胞因子。摇瓶发酵表达量达 12 0mg L ,占培养上清 30 %以上。

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhsp70 ,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果 :成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实 ,与GenBank公布的序列一致。含pGEX TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,能够表达相对分子质量 (Mr)约为 96 0 0 0的融合蛋白。结论 :获得了TBhsp70基因 ,成功地构建了原核表达质粒pGEX TBhsp70 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为其相关研究奠定了一定的基础。

结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列。将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒。将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒。Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Westernblot检测mtHSP70蛋白表达情况。结果酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达。结论含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础。

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。

人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定

目的 构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法 用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果 酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论 成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。

结核杆菌截短型热休克蛋白原核表达的实验研究

探讨结核杆菌的截短型热休克蛋白原核表达技术.以结核杆菌BCG疫苗株为模板,设计PCR引物扩增hsp65基因片段,再以pET32a(+)为载体构建pET-hsp65表达质粒.将pET-hsp65表达质粒转化大肠杆菌BL21,经0.5mM IPTG诱导后,截短型HSP65蛋白与pET32a(+)载体自身的硫氧还蛋白融合表达,融合表达蛋白的分子量约为49.8kDa.

结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的 构建结核杆菌热休克蛋白 -65 (HSP65 )真核表达质粒 ,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达 .方法 用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因 ,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( +) ,构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65 ;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549细胞 ,经G418筛选后获得抗性细胞克隆 ;用RT -PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达 .结果 经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确 ;RT -PCR检测结果发现 ,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性 .结论 真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 。

结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的高效自发再折叠和再组装

来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色性光谱比较了变性 复性前后Hsp16 3的各个层次高级结构 .结果显示 ,变性的Hsp16 3几乎可以完全恢复至天然构象 ,这表明小分子热休克蛋白Hsp16 3具有很强的自发折叠和组装能力 .

香砂六君子汤对脾胃虚弱型萎缩性胃炎大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素-6、10及热休克蛋白70表达的影响

目的观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素(IL)-6、IL-10及热休克蛋白70(HSP70)基因及蛋白表达的影响,探讨其作用机制。方法受试大鼠按随机数字表法分为空白组和造模组,采用综合法复制脾胃虚弱型CAG动物模型,将成模大鼠随机分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组。空白组和模型组大鼠予10 m L/(kg·d)蒸馏水灌胃,香砂六君子汤高、中、低剂量组分别予24、12、6 g/(kg·d)香砂六君子汤药剂灌胃,阳性对照组予0.30 g/(kg·d)维霉素药剂灌胃,连续120 d。检测各组大鼠胃窦黏膜组织IL-6、IL-10含量,实时荧光定量PCR检测胃窦黏膜组织IL-6、IL-10和HSP70 m RNA表达,蛋白免疫印迹法检测HSP70蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠一般生存状况较差,大鼠胃窦黏膜组织IL-6 m RNA表达、IL-6含量显著升高(P<0.05,P<0.01),IL-10 m RNA表达、IL-10含量显著降低(P<0.05,P<0.01),HSP70基因和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,香砂六君子汤高剂量组大鼠一般生存状况明显改善,大鼠胃窦黏膜组织IL-6 m RNA表达、IL-6含量显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-10 m RNA表达、IL-10含量显著升高(P<0.05),香砂六君子汤高、中剂量组HSP70基因和蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论香砂六君子汤对脾胃虚弱型CAG大鼠胃窦黏模具有保护作用。

热休克蛋白10和热休克蛋白的60表达、纯化及与线粒体DNA转录因子A相互结合

目的:表达、纯化热休克蛋白10(Hsp10)和热休克蛋白60(Hsp60),研究人类线粒体DNA转录因子A(TFAM)在体外与Hsp10,Hsp60间的相互交联作用。方法:使用Escherichia.Coli(E.coli)诱导表达含有6个组氨酸标记的Hsp10和Hsp60,镍离子鳌合树脂分离纯化后,体外分别与纯化TFAM共育,抗-TFAM抗体免疫沉淀,SDS-PAGE分离蛋白,CBB探测分析。结果:Hsp10可在体外与TFAM发生免疫共沉淀,Hsp60不能。结论:Hsp10可能为TFAM-复合体组分。

热休克蛋白10的研究进展

热休克蛋白(HSPs)是一类广泛存在于生物体内、生物进化高度保守、在生理和应激条件下均能表达的蛋白质家族。HSP10是该家族中的重要成员之一,广泛存在于哺乳动物的很多组织中,如骨髓、卵巢、前列腺、肝脏等。在正常细胞中,主要存在于线粒体和细胞质中。在这些组织细胞中HSP10针对不同的刺激信号,与不同辅助因子相互作用后激活或抑制下游基因的表达。近年来的研究表明,HSP10不仅参与蛋白折叠,还与细胞增殖凋亡、炎性免疫、生殖等相关。

热休克蛋白10在大肠癌发生发展中的表达及其意义

目的了解热休克蛋白10(HSP10)在正常大肠粘膜、腺瘤和腺癌中的表达,并探讨其与大肠癌发生发展的关系。方法应用免疫组化Envision二步法,观察HSP10在正常大肠粘膜、腺瘤和腺癌中的表达,并比较其间是否存在差异。结果HSP10在大肠腺瘤、腺癌中的阳性表达程度高于正常大肠粘膜(P<0.001);HSP10在不同程度不典型增生的大肠腺瘤、不同分化程度与淋巴结转移状态大肠腺癌中呈阳性至强阳性表达,统计学分析结果表明差异无显著性意义(P>0.05)。结论提示HSP10与大肠癌的发生发展有关,有可能成为检测大肠癌的早期诊断标志物;HSP10的表达与大肠腺瘤的不典型增生程度和大肠癌的分化程度、淋巴结转移状态无关。

热休克蛋白10在子宫内膜癌中的表达及意义

目的探讨热休克蛋白10(HSP10)在子宫内膜癌中的表达及意义。方法采用免疫组化Envision法检测30例正常子宫内膜、30例增生过长子宫内膜、15例非典型增生子宫内膜、50例子宫内膜癌中HSP10的分布及表达。结果 HSP10在正常子宫内膜、增生过长子宫内膜、非典型增生子宫内膜和子宫内膜癌阳性表达率分别为16.67%(5/30)、43.33%(13/30)、66.67%(10/15)、100.00%(50/50),差异有统计学意义(P<0.001);HSP10的阳性表达程度与子宫内膜癌的肌层浸润深度、宫颈受累情况有关(P<0.05),与手术病理分期、病理分级、组织学类型、腹腔积液细胞学、淋巴结转移无关(P>0.05)。结论 HSP10在子宫内膜癌的发生、发展中可能起着重要作用。

乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达

目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体,融合基因以酶切位点BamHⅠ连接,用电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为114kD,与实际大小相符,经凝胶薄层扫描分析,表达量为33mg/L,经Western印迹验证,有良好的抗原性。结论E-hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。

乙脑E蛋白与结核杆菌HSP70的融合蛋白对BALB/c小鼠特异性免疫的影响

研究酵母表达的乙脑病毒(JapaneseEncephalitisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70 (hsp70 )形成的融合蛋白对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹膜内注射蛋白的方法免疫小鼠,以直接免疫E蛋白主要抗原片段和以E蛋白主要抗原片段和单独表达的hsp70两者均以5 0pmol的量进行混合后的蛋白免疫的小鼠作为对照,用半定量RT PCR检测细胞免疫因子IL 2mRNA的水平,IL 2是细胞介导的免疫反应和巨噬细胞激活中的关键分子,MTT法检测淋巴细胞的增殖情况以及通过ELISA检测抗体水平,从这3个方面来评价融合与未融合蛋白以及等量混合后的免疫效果。结果E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70重组后,mIL 2 ,淋巴细胞的增殖以及抗体水平均较重组前明显升高,因此,以乙脑E