实时荧光定量聚合酶链式反应检测石蜡样本结核DNA时有关切片量的控制及优化

目的:探索实时荧光定量检测石蜡样本组织结核DNA时满足实验和诊断需要的切片量。方法:收集2022年11月—2023年5月病理科就诊患者的结核DNA检测标本。分析不同大小的石蜡样本组织在不同切片厚度和不同切片数量影响下的样品DNA浓度和纯度,以及聚合酶链式反应(PCR)结果和抗酸的符合率。结果:通过实时荧光定量PCR检测216例病理诊断疑似为结核患者的石蜡样本,发现规范前DNA浓度波动范围为2.25~1373.00 ng/μL,纯度波动范围为1.10~2.20;规范后DNA浓度波动范围为6.20~1380.00 ng/μL,纯度波动范围为1.80~2.27。结论:实时荧光定量PCR检测石蜡样本结核DNA时,严格规定的切片厚度、切片数量有利于确保样本DNA的浓度和纯度,确保实验的有效性,提升结核DNA检测结果和抗酸染色结果的一致性,对结核病理诊断有重要价值。

半定量法检测结核DNA疫苗中SDS残留量的方法学验证

目的建立半定量法检测十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)残留量并进行方法学验证,用于结核DNA疫苗的质量控制。方法样本中残留的SDS与吖啶橙形成复合物,用Spectra Max 340PC微孔板检测器测定该复合物的吸光度。通过定量法测定SDS的残留量时,样品的吸光度不在标准曲线线性范围内,采用对比供试品与对照溶液的吸光度的半定量法,判断供试品中SDS的残留量。结果该方法回收率范围为102%~105%,不同人员、不同时间测定结果一致,该法受辅料、测试温度、萃取时间的影响较小,测定的3批供试品SDS残留量均小于0.02%。结论建立的方法准确度、中间精密度、专属性和耐用性较好,可用于结核DNA疫苗中SDS残留量的快速检测。

结核DNA疫苗宿主蛋白残留检测方法的建立

目的建立结核DNA疫苗中大肠杆菌宿主蛋白残留量检测的方法。方法采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)建立结核DNA疫苗中宿主蛋白残留量检测的方法,对方法的准确度、专属性、线性范围和耐用性等进行验证,并采用建立的方法对结核DNA疫苗原液进行测定。结果大肠杆菌宿主蛋白含量在2~24ng·L^(-1)范围内,相关系数R 2>0.990,线性关系良好;该法宿主蛋白含量在高中低浓度范围内,回收率在70%~120%之内,准确度良好;该法不易受辅料、核酸、孵育温度和孵育时间影响,专属性和耐用性较好;三批原液的宿主蛋白残留量(HCP)均<1μg·mg^(-1)。结论此方法有较好的准确度、专属性、重复性、中间精密度和耐用性,可用于结核DNA疫苗的宿主蛋白残留量的检测。

外周血白细胞层结核DNA检测在肺结核诊断中的应用

目的 :评估外周血白细胞层结核DNA定性检测在肺结核诊断中的应用价值 ,寻找肺结核新的诊断手段。方法 :根据肺结核不同的临床表现 ,将 1 4 4例肺结核患者分为Ⅱ型肺结核痰结核分枝杆菌阳性组和阴性组及Ⅲ型肺结核痰结核分枝杆菌阳性组和阴性组。分别取静脉血 5ml进行白细胞层结核DNA定性检测 ,利用健康人静脉血作对照以对本方法进行质量控制。结果 :4 7例血行播散型肺结核组外周血白细胞层结核DNA总阳性率为 6 5 .9% ;其中 1 9例痰结核分枝杆菌阳性的患者结核DNA阳性 1 3例 ,阳性率为 6 8% ,2 8痰结核分枝杆菌阴性患者结核DNA阳性 1 8例 ,阳性率为 6 4%。 97例继发性肺结核组外周血白细胞层结核DNA阳性 6 4例 ,阳性率为 6 6 % ;其中 4 3例继发性肺结核痰结核分枝杆菌阳性组结核DNA阳性 2 8例 ,阳性率为 6 5 % ,5 4例继发性肺结核痰结核分枝杆菌阴性患者的结核DNA阳性 36例 ,阳性率为 6 7%。总之 ,肺结核组外周血白细胞层结核DNA总的阳性率为6 6 % ;痰结核分枝杆菌阳性组的阳性率为 6 6 % ;痰结核分枝杆菌阴性组的阳性率为 6 5 .8%。上述各组之间比较无统计学差异 ,P >0 .0 5。健康人组均为阴性。结论 :肺结核患者外周血白细胞层结核DNA定性检测阳性率为 6 6 % ,不受痰结核分枝杆菌检出率的影响。外周血?

血结核抗体和结核DNA联合检测对肺外结核的诊断价值

目的 肺外结核占结核病的比例较低，且部位广泛，不易获得细菌学证据，对此，采用查抗体和DNA，探讨诊断价值。方法 对肺外结核l15例采用血清TBAb血单个核细胞TBDNA联合检测。结果 肺外结核组：血抗PPD—IgG和PCR TB DNA联合检测累计阳性108例，阳性率93．9％；对照组：血抗PPD—IgG和PCR TB DNA联合检测累计阳性12例，阳性率10．7％。结论 血结核抗体和结核DNA联合检测能为肺外结核诊断提供线索。

荧光定量PCR技术检测结核DNA在不同类型样本中的应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测结核DNA在不同类型样本中的阳性率。方法收集2016年1月～2018年3月在我院进行结核DNA检测的9020例患者,运用荧光定量PCR技术检测不同类型的样本。结果 9020例患者中,检测结果阳性1220例,总阳性率13.53%;痰液检测5688例,检测结果阳性741例,总阳性率13.03%;肺泡灌洗液检测1799例,检测结果阳性363例,总阳性率20.20%;脑脊液检测704例,检测结果阳性40例,总阳性率5.68%;胸水检测559例,检测结果阳性35例,总阳性率6.26%;腹水检测62例,检测结果阳性6例,总阳性率9.68%;尿液检测193例,检测结果阳性35例,总阳性率18.13%;心包积液检测15例,检测结果阳性0例,总阳性率0。结论荧光定量PCR技术检测结核DNA具有特异、灵敏、快速、准确等特点,但临床医生应根据症状体征等选择合适的临床标本进行结核DNA的检测,将进一步提高阳性率,明确诊断。

结核杆菌DNA疫苗pVS84与pIL2质粒联合免疫的保护效率研究

目的用构建的人hIL-2质粒和结核杆菌DNA疫苗pVS84联合免疫后,对小鼠的细胞因子进行了测定并对抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的能力进行了评估。方法将hil-2插入pVAX1,构建了人hIL-2的质粒pIL2。将雌性C57BL/6鼠分成6组,分别用pVS84和pIL2各50μg,pVS84,pVAX1,pIL2S和PBS免疫3次,间隔2周,加强免疫2次。另一组用BCG(105CFU)皮内免疫1次。每组10只鼠在最后一次加强后,取脾培养,检测上清细胞因子。另10只用结核菌H37Rv攻击,2周后取脾、肝和肺培养结核菌并计数。结果pVS84+pIL2联合免疫组的鼠血清hIL-2平均浓度为720.5±114.5pg/ml,显著高于其它组。pVS84+pIL2组、pVS84组的脾细胞培养上清的mIL-2和mIFN-γ平均含量显著高于3个阴性对照组(P<0.001),与BCG免疫组无显著性差异(P>0.05)。pVS84+pIL2组脾、肝和肺的平均结核菌载量分别为12471.4±2269.3,13622.6±2404.0和14742.0±2378.7CFU/g,低于pVS84组和3个阴性对照组相应器官的结核菌载量(P<0.001),与BCG对照组无显著差异。结论pIL2质粒与pVS84联合免疫能够刺激机体产生Th1型免疫应答,抵抗H37Rv攻击的能力与BCG的效果相当。

外周血T-SPOT.TB和TB-Ab联合TB-DNA检测对菌阴肺结核的诊断价值

目的探讨外周血T-SPOT.TB、TB-Ab和呼吸道标本TB-DNA联合检测在菌阴肺结核诊断中的价值。方法回顾2015年1月—2020年7月医院收治的菌阴肺结核130例、菌阳肺结核45例及非结核肺部疾病202例临床资料,分析3组患者外周血T-SPOT.TB、TB-Ab和呼吸道标本TB-DNA的检测结果,比较3种方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率、假阴性率、诊断符合率和约登指数,并比较3种方法单独检测与联合检测对菌阴肺结核的阳性检出率的差别。结果外周血T-SPOT.TB,TB-Ab和呼吸道标本TB-DNA3种检测方法的敏感度分别为91.00%、49.07%、74.29%,特异度分别为72.94%、63.44%、98.77%;3种检测方法在菌阴肺结核中的阳性检出率分别为83.08%、53.08%、38.46%,3种方法联合检测的阳性检出率为91.54%,明显高于单项检测。结论外周血T-SPOT.TB、TB-Ab和呼吸道标本TB-DNA联合检测明显提高了菌阴肺结核的阳性检出率。

石蜡包埋脱钙骨组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较

目的探讨石蜡包埋的10%硝酸脱钙骨组织中简易有效的结核杆菌DNA提取方法并进行验证。方法以20例石蜡包埋、10%硝酸脱钙的坏死性肉芽肿炎疑为骨结核的组织标本为研究对象,常规法直接采用德国QIAGEN公司的QIAampDNA FFPE Tissue Kit方法提取DNA,而改良法中加入QIAampDNA Micro Kit试剂盒中的carrier RNA,以两种方法分别提取20例标本中结核杆菌DNA,通过荧光定量PCR,比较常规试剂盒提取法和改良提取法对结核杆菌检测结果的影响。结果改良法提取的DNA[(35.32±3.48)ng/μl]比常规法[(6.68±3.72)ng/μl]提取的DNA显著增多(P<0.05),改良法提取的DNA经荧光定量PCR检测结核杆菌的阳性率(55%)明显高于常规法(15%,P<0.01)。结论改良法提取石蜡包埋脱钙骨组织中结核杆菌DNA具有高效简便的特点,是较为理想的方法,值得在puncture和极微小石蜡样本中推广。

荧光定量PCR技术检测石蜡包埋组织结核杆菌DNA的应用评价

目的探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测石蜡包埋组织结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)在结核病诊断中的应用价值。方法 233例石蜡包埋组织标本采用实时FQ-PCR技术检测TB-DNA,同时进行抗酸染色和组织病理学检查,以临床诊断结果为金标准,分别计算TB-DNA、抗酸染色和病理学检查的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值。结果 129例临床诊断为结核病的组织标本中,TB-DNA阳性107例,TB-DNA阴性22例;104例非结核病的标本中,TB-DNA阳性2例,TB-DNA阴性102例。TB-DNA检测的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为82.95%、98.08%、89.70%、98.17%、82.25%,均高于抗酸染色的63.57%、95.19%、77.68%、94.25%、67.80%和病理学检查的77.52%、96.15%、85.84%、96.15%、77.52%。结论 FQ-PCR技术检测石蜡包埋组织的TB-DNA用于各种结核病的诊断具有灵敏度高、特异性强的优点,与病理学检查相结合可以大大提高结核病的诊断率,适合于临床推广应用。

单管巢式PCR法检测石蜡包理淋巴结组织结核杆菌DNA的评价

巢式聚合酶链反应(PCR)较普通PCR具有更高的敏感性和特异性。然而,由于巢式PCR需两次配制PCR反应体系(双管巢式PCR法),操作复杂,污染机会增加,影响实际应用。本研究采用了两对复性温度不同的巢式PCR引物,将巢式PCR扩增置于同一PCR反应体系中一步完成(单管巢式PCR法),简化了操作步骤,并应用该方法对石蜡包埋组织中结核杆菌DNA特异性序列片段进行检测。

检测LAM-IgG、TB-DNA、ADA、CEA、CEA-mRNA鉴别诊断结核性与恶性胸水

目的 评价应用胸水标本检测阿拉伯糖甘露糖脂IgG抗体(LAM -IgG)、结核杆菌DNA(TB -DNA)、腺苷脱氨酶(ADA)、癌胚抗原(CEA)和CEA mRNA等项指标诊断结核性与恶性胸水的价值。方法 结核性胸水(结核组)和恶性胸水(恶性组)各53例,采集胸水为检测标本,应用斑点免疫金渗滤试验技术检测LAM IgG、酶促反应终点法检测ADA、磁酶免技术检测CEA、聚合酶链反应(PCR)技术检测TB DNA和CEA -mRNA。结果 LAM IgG、TB DNA、ADA、CEA和CEA mRNA的阳性结果分别为:结核组32 (60.4%)、38 (71.7%)、44 (83.0%)、3 (5.7%)和4(7.5%),恶性组4(7.5%)、2(3.8%)、8(15.1%)、31(58.5%)和43(81.1%),组间比较差异有统计学意义(P均<0.01)。结论 LAM -IgG、TB -DNA在诊断结核性胸水方面具有较高的特异性和敏感性,CEA、CEA- mRNA在诊断恶性胸水方面具有较高的特异性和敏感性,ADA对两种胸水诊断的特异性较低,但敏感性较高。

联检TB-DNA、LAM-IgG和ADA诊断小儿结核性脑膜炎

目的评价联检脑脊液结核杆菌DNA(TB-DNA)、抗阿拉伯糖甘露糖脂IgG抗体(LAM-IgG)和腺苷脱氨酶(ADA)指标诊断小儿结核性脑膜炎(结脑)及评价病情的价值。方法结脑组67例、非结核组38例,脑脊液标本应用聚合酶链反应法检测AFB、斑点免疫金渗滤试验法检测LAM-IgG、酶动力学终点法检测ADA。结果TB-DNA+LAM-IgG诊断结脑的特异性为100%、阳性率为86.1%。结脑病情进展,ADA呈升高趋势;病情好转,ADA呈下降趋势。结论在诊断结脑方面,TB-DNA+LAM-IgG联合试验的应用价值明显高于经典方法;在动态了解病情方面,ADA有较高的应用价值。三者联合应用可提高对小儿结脑诊断和评价的价值。

PCR-ELISA微孔板杂交技术检测结核杆菌DNA

目的 采用PCR ELISA微孔板杂交技术检测结核杆菌DNA。方法 采用PCR技术扩增结核杆菌DNA ,并将扩增产物加入预先包被结核杆菌探针的微孔板 ,再加入结核杆菌显色探针 ,同时进行微孔板核酸夹心杂交ELISA显色。共检测肺部疾病患者痰标本 5 10例。结果 该法的灵敏度为 5 9.3% ,特异性为 95 .0 % ;阳性预测值为 96 .3% ,阴性预测值为 5 1.4 %。结论 PCR ELISA微孔板杂交技术可快速、准确地检测结核杆菌DNA ,是结核病早期诊断和鉴别诊断的可靠实验室方法。

基于离子交换色谱法检测结核治疗性DNA疫苗纯度的方法建立

目的建立并验证结核治疗性DNA疫苗纯度的高效液相色谱测定方法。方法采用TSK gel DNA-NPR(4.6 mm×75 mm,2.5μm)色谱柱,流动相:以20 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷(pH=9)为流动相A,以20 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷-1 mol·L^-1氯化钠(pH=9)为流动相B,梯度洗脱,柱温:25℃;流速:0.5 mL·min^-1;检测波长:260 nm。结果质粒DNA在0.5~2.5μg的范围内与峰面积呈良好线性关系,R^2=0.9998,该法专属性、精密度和耐用性良好,检测限为0.001 mg·mL^-1,供试品在24 h内稳定。结论该方法符合检测结核治疗性DNA疫苗纯度的要求,适用于该产品的质量控制。

精液与附睾结节穿刺标本结核杆菌DNA检测在附睾结核诊断中的价值

目的探讨精液及附睾结节穿刺标本中结核杆菌DNA含量检测在附睾结核诊断中的价值。方法对2010年1月—2018年2月诊治的42例附睾结节患者,均行附睾结节穿刺术及留取精液,将标本分为两份分别行结核杆菌DNA检测及涂片镜检结核杆菌,计算结核杆菌阳性率。结果结核杆菌DNA检测精液标本阳性率28. 57%、附睾穿刺标本阳性率42. 86%、组织标本高于精液标本P <0. 01;精液标本与附睾穿刺标本结核杆菌涂片检测阳性率比较无统计学差异(P> 0. 05)。结论对可疑附睾结核患者的精液及附睾结节穿刺应用实时荧光定量PCR方法检测结核杆菌DNA含量,是一种有价值的诊断手段。

1624例不同类型样本结核杆菌DNA检测结果分析

目的了解实时荧光PCR检测结核杆菌DNA（TB-DNA）的临床意义及不同类型样本TB-DNA检出率的差异。方法采用实时荧光PCR法,对患者的痰、血清、尿液、穿刺液、脑脊液、胸腹水进行结核杆菌DNA检测。结果 1624份样本的总阳性率为2.77%,血清样本的阳性率在所有类型样本中最低,仅为0.4%,穿刺液和尿液的阳性率较高,分别为27.27%和21.95%。有完整病历的TB-DNA阳性的患者,检测结果与临床诊断完全吻合。结论实时荧光PCR具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点,适宜多种样本类型的检测,是临床上检测TB-DNA,早期诊断结核病的有效方法。