诱导根瘤菌与稻类结瘤共生的探索研究

本文研究以植物生长素2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)处理稻苗(终浓度为1ppm)并接种根瘤菌,诱导根瘤菌与稻苗结瘤共生。自1988年以来,在一些水稻和多种早稻品种上试验,结果表明这种方法可以有效地诱导根瘤菌与稻苗结瘤共生。经多次试验,诱导结瘤的重复性和再现性都很好。不同稻品种的始瘤日期,结瘤率高低以及瘤的大小都有所差异,早稻品种凡289033、福田糯和尤旱三个品种表现结瘤率较高,瘤也较大,接种后4个星期瘤的直径约2—3mm。在10个供试品种中,凡289033的结瘤率最高,达85％。稻根瘤切片经电子显微镜观察表明,瘤组织内有数量众多的根瘤菌菌体,说明根瘤菌可以进入稻根并在瘤内繁殖。本文所揭示的根瘤菌与稻类作物之间新的共生关系,对研究非豆科作物结瘤固氮将是很有意义的。

大豆NADPH氧化酶基因GmRbohL在共生结瘤过程中的功能鉴定

植物NADPH氧化酶Rbohs是活性氧(ROS)的主要来源,参与植物的生长、发育、抗逆和植物-微生物的互作等多种生理过程。为探索Rbohs在共生固氮中的功能和作用机制,克隆了1个大豆Rbohs基因家族成员GmRbohL,利用分子生物学、细胞生物学和遗传学等方法,分别对基因的表达模式、蛋白质的亚细胞定位及基因的功能进行了研究。结果显示:GmRbohL基因受根瘤菌诱导,在大豆根和根瘤中特异性高表达。亚细胞定位分析发现,该基因编码蛋白GmRbohL是一种膜蛋白。构建了GmRbohL的植物基因沉默(RNAi)载体,利用发根农杆菌K599介导的大豆毛根转化法,得到转基因毛状根。GmRbohL的基因沉默导致转基因毛状根的根瘤数量明显减少,ROS的产生也受到了抑制。根瘤器官发生阶段根瘤菌的侵染事件明显减少,结瘤标志基因的表达水平也随GmRbohL表达量的降低而降低。根瘤组织切片显示,GmRbohL的基因沉默显著减少了根瘤侵染区共生体的数量,根瘤的固氮酶活性也相应降低。以上数据表明,GmRbohL的基因沉默降低了ROS的产生水平,显著抑制了大豆的共生结瘤过程。推测GmRbohL可能在大豆根瘤的器官发生以及固氮功能调控方面发挥重要的正调控作用。

杨梅属植物共生结瘤固氮研究进展

杨梅属35个种中有28个种能与Frankia放线菌共生结瘤固氮。根据有关文献从杨梅属植物共生固氮根瘤及其内生放线菌的形态结构、杨梅属植物根瘤内生放线菌的分类地位、杨梅属植物共生固氮放线菌的生理生化特性、环境条件对杨梅属植物根瘤共生固氮的影响以及分子生物学方法在杨梅属植物根瘤共生固氮放线菌中的应用等方面作了较为详细的阐述。

根瘤菌共生结瘤基因的分子遗传学研究进展

根瘤菌共生结瘤基因的分子遗传学研究进展①樊妙姬陈丽梅马庆生（广西大学生物技术与糖业工程学院，南宁５３０００５）ＴｈｅＡｄｖａｎｃｅｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｏｆＲｈｉｚｏｂｉｕｍＳｙｍｂｏｔｉｃＮｏｄｕｌａｔｉｏｎＧｅｎｅｓＦＡＮＭｉａｏｊ...

大豆GmCYS20基因在百脉根共生结瘤过程中的功能研究

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程。克隆了大豆的1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS20,基因编码区全长为291bp。氨基酸多序列比对分析发现,大豆GmCYS20蛋白与野生大豆cystatin蛋白相似性高达99%。构建GmCYS20基因的植物表达载体,通过发根农杆菌介导的百脉根发状根转化法获得转GmCYS20基因复合体植株,利用GUS染色和RT-PCR方法鉴定阳性发状根。复合体植株接种根瘤菌4周后,转GmCYS20基因植株结瘤数目明显高于空载体对照,结瘤指示基因的转录水平也呈上升趋势。进一步对接种10d复合体植株中根瘤菌的侵染表型进行统计发现,过量表达GmCYS20基因并不影响根瘤菌的侵染过程,而是在根瘤起始与发育阶段发挥正调控作用。结果表明:GmCYS20基因通过促进根瘤的起始与发育,从而参与调控共生结瘤过程。研究结果可为揭示豆科植物与根瘤菌的共生互作机制提供新的分子生物学证据。

诱导根瘤菌与非豆科植物结瘤人生的研究初报

长期以来针对能否使根瘤菌与非豆科作物(主要是粮食作物)结瘤,使之具有固氮能力这一问题,国内外一些专家和科技工作者进行了大量的研究,取得了很大的进展.我们在总结借鉴前人研究的经验、成果的基础上,进行了以植物激素2.4-D处理高粱、燕麦、水稻根系并接种根瘤菌,诱导根系结瘤共生的研究,取得了可喜的结果,现简报如下.

根瘤菌转录因子RluD基因突变抑制大豆共生结瘤

[目的]研究根瘤菌自身转录因子RluD在大豆共生结瘤中的作用,[方法]利用三亲杂交对根瘤菌RluD突变体进行构建,并利用PCR和qRT-PCR对突变体进行验证。利用大豆结瘤实验,测定RluD突变对根瘤菌结瘤能力的影响。最后,利用转录组对RluD突变所影响的信号通路进行了研究。[结果]根瘤菌转录因子RluD突变能够抑制根瘤的产生,显著降低大豆植株根瘤数和根瘤干重,根瘤数由每株17.0下降到12.0,根瘤干重由每株24.0 mg下降到18.0 mg。表达量分析表明,在大豆共生结瘤过程中RluD所调控的基因能够参与到大豆的免疫信号途径。转录组结果表明,转录因子RluD主要参与根瘤菌ABC转运,鞭毛组装,胞外多糖生物合成,细菌分泌系统,碳代谢等通路。[结论]根瘤菌转录因子RluD能够正调控大豆共生结瘤,其突变情况下能够降低29.4%的根瘤数和25.0%的根瘤干重。

结瘤信号途径中相关调控蛋白的研究进展

以模式豆科植物与根瘤菌的共生固氮为视角,介绍近年来在结瘤信号途径中筛选到的能够与已知关键调控蛋白相互作用的新蛋白,综述了相关新蛋白在共生结瘤过程中发挥的重要作用,进一步补充和完善了结瘤早期信号转导途径,为豆科植物与根瘤菌共生关系的研究提供参考.

豆科植物根瘤菌结瘤因子的感知与信号转导

结瘤因子(脂壳寡糖,lipo-chito-oligosaccharides,LCOs)是根瘤菌在宿主植物根系分泌的类黄酮的作用下,合成并分泌的一类多糖信号分子,在根瘤菌与植物的共生结瘤过程中起重要作用。结瘤因子通过一定的机制感知,与某种特定受体(结瘤因子结合蛋白)结合,通过结瘤因子激活的信号转导途径如Ca2+介导的信号转导途径或磷酸类脂信号转导途径,诱导宿主植物的一系列反应,如根毛质膜去极化、皮层细胞分裂和结瘤素基因表达等。同时,结瘤因子的感知与信号转导也受一定基因和反馈机制调控。就豆科植物根瘤菌结瘤因子感知机制、信号转导途径及反馈调控等方面的研究进展进行了全面阐述。

大豆蛋白磷酸酶基因GmPP2C28的克隆与表达分析

为解析植物蛋白磷酸酶2C(PP2C)在豆科植物与根瘤菌共生互作过程中的作用,以大豆为研究材料,克隆了大豆的一个蛋白磷酸酶基因GmPP2C28,并对其编码蛋白进行了亚细胞定位,随后在大肠杆菌中对其重组蛋白进行了表达和纯化。此外,通过荧光定量PCR技术,分析了GmPP2C28基因在大豆不同组织及接种根瘤菌后不同时期根系中的表达模式。结果表明,GmPP2C28完整编码区的cDNA序列长度为1029 bp,编码343个氨基酸,其编码蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核。体外重组蛋白以可溶形式高效表达,目的条带大小为37 kD左右。GmPP2C28基因在大豆的根和根瘤中表达水平较高,在接种根瘤菌后的大豆根中表达水平呈现先升高再下降的表达模式。

紫花苜蓿根瘤菌竞争结瘤的研究进展

很多研究表明,紫花苜蓿根瘤菌竞争结瘤在共生结瘤过程中起着重要的作用,而影响紫花苜蓿根瘤菌竞争结瘤的因素很多,本文就概述了根瘤菌、苜蓿和苜蓿根瘤菌与苜蓿之间的亲和性三方面对苜蓿根瘤菌竞争结瘤的影响。

百脉根LjSERKs基因家族在根瘤共生中的功能鉴定

为探索百脉根中的体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶基因(somatic embryogenesis receptor-like kinases,SERKs)家族在根瘤共生过程中的功能和作用机制,根据拟南芥AtSERKs基因序列,从百脉根基因组中鉴定到8个同源基因(LjSERKs)。利用CRISPR-Cas9基因组编辑和毛根转化技术,分别敲除LjSERKs家族不同基因,观察并分析其对共生结瘤表型的影响。结果显示:敲除LjSERK2、LjSERK3、LjSERK6和LjSERK7后,其植株结瘤数与对照植株相比均无明显差异;敲除LjSERK8后,植株结瘤数显著减少。这些结果表明LjSERK8参与根瘤共生过程,而该家族其他基因间可能存在功能冗余现象。

大豆GmNARK基因家族鉴定及分析

GmNARK(Nodule autoregulation receptor kinase)对植物发育及植物与微生物间相互交流具有重要调控作用,是结瘤自动调节(Nodulation,AON)过程中最重要的调节因子之一。文章通过GmNARK蛋白三级结构及其定位信息预测,对GmNARK基因家族进行鉴定及功能预测。结果表明,GmNARK主要定位于细胞质中,其三级结构存在多处α-螺旋和β-折叠区域。家族成员分别分布在10条染色体上,同时有两个相同结构域(Malectin和Pkinase_Tyr)及相似基序分布。共线性分析表明该家族基因发生8次复制事件。通过启动子顺式作用元件和基因表达模式对NARK基因家族成员功能进行预测表明其对光反应具有调控作用,对植物激素和植物生长存在潜在调节机制,不同亚族成员表达模式不同。

我国西北部分地区豆科植物根瘤菌资源调查研究

通过对青海、甘肃、宁夏和陕西部分地区豆科植物根瘤菌资源调查,共采集到根瘤样品1850份,包括野生和栽培豆科植物有20属41种,采集的根瘤86%着生在侧根或须根上,根瘤的形状主要有棒状、掌状、球状、珊瑚状,颜色多为黄色、粉色,少数呈白色或褐色。调查研究发现,六盘山棘豆为新发现的豆科结瘤植物;兴隆山棘豆为青海新记录植物。豆科植物与根瘤菌共生结瘤及根瘤特征,除了与寄主植物的遗传特性、发育时期有关外,还与其所处的生态环境(水分、温度、光照、土壤结构、土壤pH等)有密切的关系。

百脉根小G蛋白Rac1基因的克隆与功能分析

小G蛋白Rop在植物细胞信号转导中发挥着重要的分子开关功能。该实验通过RT-PCR方法克隆了百脉根的一个Rop编码基因LjRac1,并对LjRac1基因序列进行生物信息学分析,然后采用半定量RT-PCR检测LjRac1基因在百脉根不同组织中的表达,用荧光实时定量PCR方法检测百脉根接种根瘤菌后LjRac1基因在不同阶段根系中的表达,构建过表达重组质粒,利用发根农杆菌介导的遗传转化法对LjRac1基因功能进行分析。结果表明:(1)序列分析显示,LjRac1完整编码区的cDNA序列长度为594bp,编码197个氨基酸,其编码蛋白具有典型的Rop家族保守结构域;同源分析显示,百脉根LjRac1与大豆GmRac1、野大豆GsRac1的一致性最高(94.42%)。(2)LjRac1基因在百脉根的根、茎、叶、根瘤和花中均有表达,且在根和根瘤中的表达水平较高;接种根瘤菌0.5h后,LjRac1基因在根系中的表达量呈显著升高趋势。(3)过表达转基因植株中LjRac1mRNA的表达水平为对照植株的14.3倍,且过表达植株的结瘤数目较对照明显增加。研究认为,LjRac1基因是一个受根瘤菌诱导增强表达的基因,过表达LjRac1基因可以引起植株结瘤数目的增加,说明LjRac1基因可能参与早期结瘤信号转导途径,从而在根瘤的发育中发挥一定作用。

NaCl胁迫对蒺藜苜蓿生长发育及共生结瘤的影响

采用温室盆栽试验,研究不同浓度(0、50、100、150、200和250 mmol·L-1) NaCl处理对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)生长发育及共生结瘤的影响。结果表明:在共生固氮和施加氮肥两种条件下,低浓度(50 mmol·L-1)NaCl处理对苜蓿生长发育均没有明显影响;随着NaCl浓度的升高,苜蓿生长受到明显的抑制,且抑制程度与NaCl浓度呈正相关;对比两种条件下苜蓿生长受盐胁迫的程度发现,施氮处理的苜蓿的各项生长指标普遍优于共生固氮的苜蓿,表明后者对盐胁迫更敏感。进一步研究NaCl胁迫对苜蓿共生结瘤的影响发现盐浓度≥100 mmol·L-1时,随着浓度的升高,根瘤数量不断减少,根瘤不断变小,同时固氮区细胞数量也相应减少。可见,苜蓿能够耐受低浓度的盐胁迫,但中高浓度(≥100 mmol·L-1)盐胁迫显著抑制了其生长发育及共生结瘤过程,这一结果为盐地苜蓿育种及栽培提供理论指导。

Rpfan37在刺槐共生结瘤过程中的功能探究

目的：研究刺槐中与磷脂酰肌醇转运蛋白有较高同源性的基因Rpfan37的功能,为探究相关基因参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程提供新的思路。方法：通过前期研究,建立豆科植物刺槐与共生根瘤菌互作的抑制差减杂交反交文库,筛选疑似与共生结瘤相关的基因。利用PCR技术快速克隆经实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）分析基因在不同接菌时间及不同植物组织的表达。构建RNA干扰（RNAi）重组载体,转农杆菌介导转化植物根部,接种根瘤菌后验证该基因在刺槐共生结瘤过程的功能。结果：基因表达分析显示,在接菌与未接菌的刺槐根中,处理后第15天,Rpfan37表达均显著上调,但接菌与未接菌处理对该基因表达无显著影响;在成熟的根瘤中,该基因仅为低水平表达。RNAi转化植株的鲜重、株高、根长及结瘤数较对照组显著降低。在显微镜下观察到RNAi植株根毛发育异常;与对照相比,RNAi转化植株形成的根毛卷曲、根毛侵染线及根瘤原基数目均显著降低。根瘤石蜡切片结果显示RNAi植株根瘤中的侵染细胞与对照相比明显减少,分析豆血红蛋白表达发现,RNAi植株中根瘤发育成熟过程明显受阻。结论：在豆科植物刺槐中发现的相关基因Rpfan37能够参与刺槐共生结瘤过程,为研究磷脂酰肌醇转运蛋白在共生结瘤过程中的作用提供了新的理论基础。

大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS2的功能鉴定

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin,CYS)在结瘤,根瘤发育和衰老过程中起重要作用。本研究克隆了1个大豆CYS家族基因GmCYS2,氨基酸序列比对及进化树分析表明,GmCYS2与木豆(Cajanus cajan)CYS相似性最高。在体外对该基因编码蛋白进行了表达和纯化,重组蛋白GmCYS2的酶活性抑制实验显示,该蛋白对L类和B类组织蛋白酶的抑制活性明显高于对H类组织蛋白酶,并且在30 d根瘤提取物中的抑制活性高于在60 d根瘤提取物中。此外,构建GmCYS2的植物表达载体,通过百脉根毛根转化法获得转GmCYS2基因的超表达复合体植株。GmCYS2的超量表达增加了百脉根的结瘤数目,并且上调共生标记基因的表达。结果说明GmCYS2蛋白具有一定的酶活性抑制作用,并且正调控百脉根共生结瘤过程。

“富思德”根瘤菌剂在花生上的应用试验

根瘤菌剂接种花生后．便与花生植株体形成了良好的共生结瘤固氮体系，能将空气中的分子态氮转变为化合态氮，供给根瘤和花生植物利用，它可以为豆科植物提供所需氮量的30％～66％（周平贞，胡济生，1990）。土壤中有效根瘤菌的数量是决定豆科植物产量的重要因素，而根瘤菌剂的使用可以有效地提高土壤中的根瘤菌数量（管凤贞等，2012）。

硝酸盐抑制共生结瘤的新机制

豆科植物根系不仅可以直接从土壤中吸收氮素，还能与根瘤菌共生互作形成根瘤，根瘤菌在根瘤中将N2还原成NH4^＋为植物所用。根瘤菌固氮是一个非常耗能的过程，当土壤中存在充足氮素时共生结瘤过程被强烈抑制，该现象被称为“氮阻遏”。