用发光酶基因(luxAB)标记法研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力

lux AB基因标记是一种新型基因标记技术 ,在很多研究领域都有着良好的应用前景。研究通过三亲本杂交将 lux AB基因成功地向慢生型花生根瘤菌进行了转移 ,并获得了一株带 Lux AB基因标记的菌株Cspr7- 1。对 Cspr7- 1进行性状、标记基因的遗传稳定性检测 ,结果表明 ,Lux AB基因不仅能有效表达 ,而且性状稳定。在无氮水培条件下进行标记菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤试验。结果证实 ,Cspr7- 1在植物根系上的占瘤率平均达到 61 .3% ,比土著根瘤菌的竞争结瘤能力强 ,而且 Cspr7- 1在主根上的侵染能力远较侧根上的强 ,平均高出 2 2 .3%～ 39.6%。

大豆根瘤菌HD001的分离鉴定及结瘤能力检测

通过对绥农14根瘤菌的分离鉴定,最终得到可以在绥农14上高效结瘤的寒地大豆根瘤菌,命名为HD001。III型效应因子诱导分析表明HD001具有较特异的分泌谱带,与HH103相比较至少具有4条带型差异。对根瘤菌的基因组和抗生素抗性进行了初步分析,证明HD001具有羧苄青霉素(Cb)抗性。并在东北218份大豆种质资源上对其进行结瘤实验鉴定,其中高效结瘤资源10份,低效结瘤资源11份。这些资源对大豆与根瘤菌共生结瘤机制的深入研究具有重要意义。

费氏中华根瘤菌内源质粒和大豆品种对菌株竞争结瘤能力及固氮效率的影响

采用发光酶基因 (luxAB)标记技术 ,在无菌砂培条件下测定了费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii)内源质粒和大豆品种对供试菌株竞争结瘤和固氮效率的影响。结果表明 ,供试菌株的固氮效率主要由共生质粒所决定 ;而竞争结瘤能力主要取决于其染色体所携带的基因 ,内源质粒 (包括共生质粒和非共生质粒 )对供试菌株竞争结瘤能力没有明显的影响。菌株的竞争结瘤能力对供试的大豆品种依赖性较小 。

两株花生根瘤菌的比较研究及结瘤能力的测定

从花生根瘤中筛选出两株生长速度差异明显的花生根瘤菌:1K(快生型),2M(慢生型),通过16S rDNA测序分析并结合生理生化实验确定两种根瘤菌分别为中华根瘤菌和慢生根瘤菌。对二者的生理特性、抗逆性和结瘤能力等指标进行了研究,发现慢生型虽然在生长速度、抗逆性等方面明显不及快生型,但是结瘤能力比快生型要强。

接种根瘤菌对绿肥作物毛苕子结瘤能力的影响

在种植绿肥作物毛苕子时,将种子进行根瘤菌接种处理,能促进毛苕子根瘤的形成、生物量累积增加。

慢生根瘤菌接种花生的结瘤能力

为筛选合适的花生根瘤菌菌株及提高花生产量提供理论依据,选用分离自花生(DASA03005、DASA 03183和DASA 03028)与合萌(ORS 278与STM 6978)的5种慢生根瘤菌,人工接种至花生植株,检测植株结瘤数,采用乙炔还原法测定固氮酶活性;采用BOX-PCR指纹图谱分析技术,比较接种菌株与结瘤菌株的DNA指纹图谱,揭示菌株基因组的差异。结果表明:菌株DASA 03005和ORS 278不能与花生形成结瘤,DASA 03028、DASA 03183和STM 6978能与花生形成结瘤,且接种DASA 03028、DASA03183菌株的花生其单株植株结瘤数和生物量都大于接种STM 6978菌株的;菌株DASA 03028、DASA03183和STM 6978与结瘤菌株的DNA指纹图谱基本一致,菌株DASA 03005和ORS 278则与结瘤菌株的差异较大。接种菌株的结瘤数越多,花生植株的干重越重,固氮酶活性越强,地表植株的生物量也相应较大。

根瘤菌剂和种衣剂拌种对不同品种大豆结瘤能力和产量的影响

分析不同品种大豆结瘤能力和产量在根瘤菌剂和种衣剂拌种下的表现,从而选择最佳的根瘤菌剂和种衣剂,提高大豆结瘤能力和产量。以辽豆14和辽豆17作为主要研究对象,共设置3个处理,不拌种、10^(10)CFU/mL大豆慢生根瘤菌、6.25%精甲霜灵·咯菌腈悬浮种衣剂,分析不同处理对不同品种大豆结瘤能力和产量的影响。经过根瘤菌剂拌种后的辽豆17的根瘤数、根瘤干重、根瘤鲜重均优于辽豆14,辽豆17分别增加26.15%、27.47%、22.73%;经过根瘤菌剂拌种后的辽豆17的根瘤数、根瘤干重、根瘤鲜重优于不拌种,辽豆17分别增加22.39%、17.17%、8.00%;经过悬浮种衣剂拌种的大豆土壤无机氮含量低于不拌种,根系生物量高于不拌种。辽豆14经过根瘤菌剂和悬浮衣剂处理后,大豆产量相对稳定;辽豆17经过根瘤菌剂拌种后产量有所增加,增加15.21%,用悬浮种衣剂拌种后产量无明显增加。根瘤菌剂更能提高不同大豆品种的产量。

用AFLP技术检测慢生型花生根瘤菌竞争结瘤的研究

以 5株慢生型花生根瘤菌和天府 3号花生为材料 ,用 AFLP技术研究了慢生型花生根瘤菌 Spr2 - 9、Spr3- 3、Spr3- 5、Spr4- 5和 Spr7- 1的遗传特性和竞争结瘤能力。结果显示 ,供试条件下 ,传代次数对菌株的遗传性状无明显影响 ,2 8℃培养条件下 ,花生根瘤菌连续传 96代 ,其 AFLP指纹未发生明显变化 ;37℃培养 ,仅 Spr3- 3和 Spr3- 5能够存活并正常生长 ,其 AFLP指纹也未发生明显改变 ,然而其它菌株不能生长。将供试慢生型花生根瘤菌分别接种天府 3号花生 ,光照培养 30 d后 ,随机各取 4个根瘤 ,从根瘤中提取类菌体 DNA进行 AFLP分析 ,各根瘤类菌体 DNA的 AFLP指纹图谱与该菌株纯培养物 AFLP指纹相同。将 5个菌株混合接种天府 3号花生 ,不同菌株的占瘤率存在差异 ,Spr3- 3和 Spr3- 5的竞争结瘤能力最强 ,两菌株的占瘤率之和为 85.4% ;Spr4- 5的占瘤率为 1 2 .2 % ;Spr7- 1为 2 .4% ;而 Spr2 - 9的竞争结瘤能力最差。本试验结果说明 ,AFLP技术用于根瘤菌生态和竞争结瘤能力研究 ,具有下列优点 :简易、快速、准确 ;直接取豆科植物的根瘤提取 DNA,进行原位研究 ;在不改变菌株遗传特性 ,即不使用突变株的前提下 。

哈茨木霉发酵液中肽类物质对豇豆土著根瘤菌竞争结瘤的影响

通过树脂吸附、离子交换、薄层层析、高效液相色谱系统以及紫外、质谱等分离、纯化和鉴别的方法,从哈茨木霉T2-16菌株发酵液中分离得到一种对豆科作物生长具促进作用的肽类物质。用该肽类物质对豇豆土著根瘤菌进行处理后,用AFLP技术研究了该物质对供试根瘤菌遗传稳定性和在土壤中竞争结瘤能力的影响。结果表明,传代次数和培养温度（28℃-36℃范围）对供试根瘤菌的遗传性状无明显影响,其AFLP指纹未发生明显变化;但经木霉肽类代谢产物处理后,根瘤菌竞争结瘤能力得到提高,为对照根瘤菌的1.53倍。

间歇性干旱对苜蓿根瘤形成的影响

模拟田间土壤干湿交替及其强度,研究灌溉模式对苜蓿(Medicago sativa L.)根瘤菌有效性的影响,以及间歇性干旱对寒旱区苜蓿根瘤形成的影响。结果表明:间歇性干旱将影响苜蓿根瘤的正常发育,且周期越长,对根瘤菌的有效性影响越大;不论土壤是否缺水,根瘤均随着生长期的延长不断向侧根转移;当土壤持水量为32.7%,一次灌水达土壤持水量的80%,间歇干旱20 d、30 d和一次灌水达土壤持水量的50%,间歇干旱20 d两种水分控制模式均可保持根瘤菌较高的结瘤能力。

导入dctABD和nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮的影响研究

以pTR10 2为载体构建重组质粒pHN30 7,其上克隆有来自苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti)的四碳二羧酸转移酶基因dctABD、来自肺炎克氏杆菌 (Klebsiellapneumoniae)的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶基因lux AB。经三亲本接合转移 ,将pHN30 7导入费氏中华根瘤菌 (S .fredii)HN0 1、YC4和GR3,并考察了转移接合子中pHN30 7在传代培养和共生条件下的稳定性。与出发菌相比较的植物盆栽试验结果表明 ,在与大豆黑农 33共生时 ,导入pHN30 7后的转移接合子均可显著提高结瘤植株的瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量。在与大豆川早一号共生时 ,转移接合子HN0 1(pHN30 7)可显著提高结瘤植株的瘤数和瘤重 ;GR3(pHN30 7)可显著提高结瘤植株的瘤数、瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量 ;导入pHN30 7的YC4却呈现出负作用。本研究表明 ,导入dctABD可提高固氮效率 ,而nifA基因主要影响重组菌的结瘤能力 。

木本豆科植物根瘤菌资源及多样性研究进展

与木本豆科植物共生的根瘤菌为其宿主提供了相当数量的氮素,这些根瘤菌在分类地位上可归入不同的属、种,说明它们的多样性及与木本豆科植物共生关系的混杂性。另外从木本豆科植物上分离的根瘤菌还有较强的抗性,是宝贵的种质资源。

导入额外拷贝nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

以广宿主、稳定性质粒pTR102为载体构建重组质粒pHN306，其上克隆有来自肺炎克氏杆菌（Klebsiellapneumoniae）的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶标记基因（luxAB）。经三亲本接合转移，将pHN306导入费氏中华根瘤菌（Sinorhizobiumfredii）HN01，GR3和YC4。与出发菌相比较的盆栽试验结果表明：HN01（pHN306）和GR3（pHN306）分别在大豆渝豆一号和黑龙33上能显著提高瘤数，瘤重，植株地上部分干重和总氮量，YC4（pHN306）在大豆渝豆一号上也能显著提高瘤数，癌重和总氮量，对植株地上部分干重表现出一定的促进作用。结果表明：nifA基因对固氮效率和结瘤能力的促进作用与受体根瘤菌和大豆品种等因素有关。以luxAB为报告基因进行的菌落和根瘤发光检测结果表明：pHN306可在供试根瘤菌中稳定遗传。

大豆根瘤菌效应因子NopA的突变对共生结瘤的影响

[目的]为了探究根瘤菌Ⅲ型效应因子在大豆-根瘤菌共生体系形成过程中作用。[方法]通过三亲杂交的方法进行根瘤菌NopA突变体的构建,并利用PCR和qRT-PCR对突变体进行验证。在染料木苷诱导情况下,纯化根瘤菌胞外蛋白,利用Ⅲ型效应因子NopL及NopT的抗体对纯化蛋白进行检测。将野生型菌株HH103和NopA突变体共同接种大豆,测定NopA突变对根瘤菌结瘤能力的影响。[结果]根瘤菌效应因子NopA突变能够抑制NopL和NopT的分泌。结瘤能力鉴定表明,NopA突变能够显著降低东农50大豆植株根瘤数和根瘤干重,根瘤数由每株31.9下降到21.6,根瘤干重由每株33.9 mg下降到20.5 mg。共生结瘤Marker基因表达量分析表明,在根瘤菌侵染过程中,NopA能够促进GmPR1和PR5的表达。[结论]证明了根瘤菌Ⅲ型效应因子NopA能够影响其他Ⅲ型效应因子的分泌,并且能够正调控大豆-根瘤菌共生结瘤。

固氮正调节基因nifA促进大豆根瘤菌的结瘤效率

先前的工作指出nifA不仅调节nif/fix基因的表达,同时可能也调节包括根瘤形成和维持根瘤功能中的一些基因.通过在大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii HN01中引入额外组成型表达的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）nifA,研究固氮正调节基因nifA对共生结瘤过程的影响.研究结果发现,引入Kp nifA可提高大豆根瘤菌的结瘤活力及竞争结瘤能力.同时初步试验结果证实,带额外nifA的大豆根瘤菌比野生型大豆根瘤菌具有更高的结瘤因子活性.推测nifA对结瘤过程的促进作用可能作用于根瘤菌的结瘤因子合成阶段.由于结瘤因子是诱导宿主形成根瘤的主要信号分子,而结瘤过程具有自我调节作用,植株一旦结瘤,就会抑制进一步结瘤,因此引入固氮正调节基因nifA能提高结瘤效率.