银杏叶提取物对肝星状细胞增殖及转化生长因子和结缔组织生长因子基因表达的影响

目的:研究银杏叶提取物对肝星状细胞增殖及细胞因子TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表达的影响,以探讨银杏叶提取物抗肝纤维化的可能机制。方法:用不同浓度(0、1、10、100、500mg/L)的银杏叶提取物处理HSC-T6,用MTT及流式细胞仪检测其对肝星状细胞增殖及细胞周期的影响,用RT-PCR及Western blotting检测培养24h及48h后各组细胞中TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白的表达。结果:银杏叶提取物10、100、500mg/L可抑制肝星状细胞的增殖,与空白对照组相比,G0/G1期DNA含量逐渐增加(P<0.05或P<0.01),S期DNA含量则逐渐降低(P<0.01),增殖指数(PI)逐渐降低(P<0.05或P<0.01);24h各组TGF-β1mRNA及蛋白表达较对照组分别低(28±4)%、(39±4)%、(45±3)%(P<0.01);(27±4)%、(37±4)%、(41±3)%(P<0.01);48h组各组TGF-β1mRNA及蛋白表达较对照组分别低(35±4)%、(49±3)%、(54±3)%(P<0.01);(33±4)%、(48±3)%、(52±3)%(P<0.01);4h各组CTGF mRNA及蛋白表达较对照组分别低(29±6)%、(45±4)%、(56±3)%(P<0.01);(36±4)%、(48±4)%、(49±3)%(P<0.01);48h组各组CTGF mRNA及蛋白表达较对照组分别低(48±6)%、(57±4)%、(69±3)%(P<0.01);(44±6)%、(58±4)%、(62±3)%(P<0.01)。结论:银杏叶提取物可能通过抑制肝星状细胞的增殖,抑制细胞因子TGF-β1、CTGF基因的表达发挥其抗肝纤维化的作用。

结缔组织生长因子基因的克隆

目的 克隆细胞即刻早期基因反应产物人结缔组织生长因子 (CTGF)基因 ,对分析细胞基因反应及用于创伤修复研究的理论和应用研究均具有较大意义。方法 使用组织培养的方法 ,建立了人脐静脉内皮细胞系 ,在适当刺激后 ,提取 m RNA,应用 RT- PCR方法 ,分段克隆人结缔组织生长因子基因 ,并经无义突变形成酶切位点使之连接。结果 经序列测定 ,发现该 CTGF基因具有完整编码区及不同于文献报道的 3′端非编码区结构的结缔组织生长因子基因。结论 获得一个新的人 CTGF基因。

病理性瘢痕中结缔组织生长因子基因的表达

目的 探讨结缔组织生长因子在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩发病机制中的作用。 方法 分别留取正常皮肤 5例、增生性瘢痕 15例和瘢痕疙瘩 7例组织标本 ,测定组织中羟脯氨酸含量 ,通过逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)和图像定量分析 ,检测组织中结缔组织生长因子基因表达水平。 结果 正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中羟脯氨酸含量分别为 (2 6 .5 2± 4 .10 )、(84 .10± 1.76 )和 (92 .38± 2 .0 4 )μg/ mg,后两者与前者比较差异有统计学意义 (P<0 .0 1) ;正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中结缔组织生长因子 m RNA指数分别为 0 .0 9± 0 .2 5、0 .78± 0 .6 3和0 .84± 0 .0 4 ,后两者与前者比较差异有统计学意义 (P<0 .0 1)。 结论 结缔组织生长因子在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩纤维化进程中可能起着促进作用。

反义ERK2基因对结缔组织生长因子诱导肾小管上皮细胞向间充质转化的调控效应

目的研究细胞外信号调节激酶2(ERK2)信号转导通路对结缔组织生长因子(CTGF)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)向间充质细胞转化的调控效应。方法腺病毒介导的反义ERK2基因(Adanti-ERK2)按感染强度50、100、200转染HK-2细胞,确定最适感染强度。按作用因素的不同将HK-2细胞分为对照组、Ad-LacZ组、CTGF组和Adanti-ERK2组。免疫组织化学检测E-Cadherin和Vi mentin的表达,Western blot法检测E-Cadherin、Vi mentin及ERK2的表达变化;细胞接种Boyden小室1、3、5 d时检测各组HK-2细胞迁移数目的变化。结果①Adanti-ERK2转染HK-2细胞最适感染强度为100。②HK-2细胞在CTGF刺激下E-Cadherin蛋白表达明显减少,Vi mentin表达增加,同时细胞内的ERK2蛋白表达显著增加;而Adanti-ERK2组E-Cadherin和Vi mentin表达变化不明显,ERK2蛋白表达较对照组明显减少。③接种5 d,HK-2细胞在CTGF刺激下细胞运动能力显著高于其他各组,而Adanti-ERK2组与对照组和Ad-LacZ组相比差异无显著性意义。结论以反义ERK2基因治疗可以有效阻断CTGF诱导的肾小管上皮细胞向间充质转化。提示ERK2信号转导通路在该转化中发挥重要作用。

免疫性肝纤维化大鼠结缔组织生长因子、转化生长因子β1基因相关表达及汉丹肝乐的影响

目的 研究结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)mRNA与转化生长因子β1(transform inggrowthfactorβ1,TGFβ1)mRNA在免疫性大鼠肝纤维化中的表达状况及汉丹肝乐对其的影响作用。方法 用猪血清腹腔内注射复制免疫损伤性肝纤维化模型,造模同时给予汉丹肝乐口服作为肝纤维化防治组;免疫攻击12周后处死动物。原位杂交方法检测肝内CTGFmRNA、TGFβ1mRNA表达。结果 12周后模型组大鼠形成典型的肝纤维化,肝内CTGFmRNA与TGFβ1mRNA表达均显著增强,同时二者阳性分布部位相近,表达程度呈正相关性;以汉丹肝乐防治的大鼠,肝纤维化程度明显减轻,CTGFmRNA和TGFβ1mRNA表达的阳性指数下降,且CTGFmRNA表达与组织病理上肝纤维化变化呈正相关性。结论 CTGF与TGFβ1基因的增高表达与肝纤维化形成有密切关系;汉丹肝乐能有效抑制CTGF与TGFβ1基因的表达。通过在转录环节上阻断肝纤维化相关的细胞内信号转导途径,可能是该药物作用的重要分子机制之一。

人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒的构建及活性检测

背景:前期试验显示单个病毒载体介导的多基因共表达系统能够显著提高椎间盘退变转基因疗效。目的:构建人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒。方法:应用全基因合成技术,以"自剪切多肽2A"串联目的基因,并克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒Lenti-TGF-β3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1。转染293细胞后,应用RT-PCR和Western-Blot技术分别检测转染后不同时间点目的基因mRNA和蛋白质表达水平。结果与结论:RT-PCR和Western-blot技术检测结果显示重组质粒成功表达了3种目的基因,并于转染后48h左右达到峰值,"2A"结构下游基因蛋白质表达量约为上游基因的80%。说明成功构建了携带人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因的慢病毒多表达质粒。

雌二醇对奶牛子宫内膜组织中结缔组织生长因子基因表达的影响

观察雌二醇(17β-estraidol,E_2)对奶牛子宫内膜组织中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)mRNA表达的影响,并探讨雌激素对奶牛子宫内膜组织修复的机制。体外培养奶牛子宫内膜组织,应用荧光定量PCR技术检测E_2对奶牛子宫内膜组织中CTGF mRNA表达的影响。结果显示,与空白对照组相比较,E_2能够极显著(P<0.01)地抑制CTGF mRNA的表达。由研究结果可知,E_2能够对奶牛子宫内膜组织中CTGF的基因表达产生调节作用。

厄贝沙坦联合黄芪注射液对老年糖尿病肾病患者结缔组织生长因子的影响

目的观察厄贝沙坦+黄芪注射液对老年糖尿病肾病(DN)患者的血清及尿液中结缔组织生长因子(CTGF)的影响及临床意义。方法早期DN患者据治疗方案随机分为厄贝沙坦组、黄芪注射组、厄贝沙坦+黄芪注射组和对照组各28例。比较4组治疗疗效、血糖、肾功能相关指标及血清、尿液CTGF水平差异。结果 4组治疗有效率有显著差异(χ2=29.97,P<0.01),厄贝沙坦+黄芪组有效率最高;治疗前4组空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(Hb A1c)、尿微量白蛋白排泄率(UAER)、血肌酐(Scr)、血清CTGF及尿液CTGF水平无统计学差异(P>0.05),而治疗后4组FPG(F=10.24,P<0.01)、Hb A1c(F=9.873,P<0.01)、UAER(F=39.68,P<0.01)、Scr(F=13.43,P<0.01)、血清CTGF(F=64.24,P<0.01)、尿液CTGF(F=49.53,P<0.01)均有显著差异,且均为对照组水平最高,厄贝沙坦+黄芪组最低。结论厄贝沙坦联合黄芪注射液能够显著降低DN老年患者的血清、尿液CTGF含量,对于DN的疗效更佳。

结缔组织生长因子增加TGFβ活化成肌纤维细胞的作用

探讨结缔组织生长因子 (CTGF)对转化生长因子 β1(TGFβ1)诱导成肌纤维细胞的影响及其与Smad信号通路的关系。细胞免疫组化检测成纤维细胞表型转化。Western免疫印迹法检测细胞α 平滑肌肌动蛋白 (α-SMA)及磷酸化Smad2的水平 ,免疫共沉淀检测Smad2 / 3与Smad4复合物的水平 ,提取核蛋白后再用Western免疫印迹法检测Smad2在细胞核内的聚积。结果显示CTGF不能使细胞表达α-SMA ,TGFβ1显著促进α- SMA表达 (p <0.0 1) ,CTGF加TGFβ1共同刺激又明显高于TGFβ1(p <0. 0 5 )。TGFβ1可明显诱导Smad2磷酸化、Smad2 / 3,4复合物形成以及Smad2在细胞核内的聚集 ,CTGF加TGFβ1联合刺激与TGFβ1相比没有明显变化。提示CTGF可以增强TGFβ1诱导的成肌纤维细胞生成 。

环氧合酶-2抑制剂对梗阻性肾病大鼠肾组织结缔组织生长因子表达的影响

目的:探讨环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib)对梗阻性肾病大鼠模型肾组织结缔组织生长因子(CTGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响及机制。方法:采用单侧输尿管结扎(UUO)建立梗阻性肾病模型,并随机分为模型组和治疗组,另设假手术组作对照。治疗组每日给予塞来昔布100mg/kg,模型组、假手术组每日给予等体积的生理盐水于造模前1d至造模后14d灌胃,分别于UUO后3d、7d、14d分批处死,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TGF-β1、CTGF的基因表达,免疫组化技术检测TGF-β1、CTGF、α-SMA、FN的蛋白表达,放免法检测组织内cAMP的水平。结果:与假手术组相比,模型组TGF-β1、CTGF的基因表达显著上调,cAMP的水平下降(P<0.001)。塞来昔布对梗阻肾TGF-β1的表达无显著改变,但能升高组织内cAMP水平,抑制CTGF的表达,纤维化程度减轻。结论:在梗阻性肾病大鼠中TGF-β1、CTGF的表达均显著升高,选择性COX-2抑制剂通过升高组织内clip的水平来抑制TGF-B的下游因子———TGF的表达延缓肾间质纤维化。

siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用

目的研究化学合成的小分子干扰RNA (siRNA)对鼠肝星状细胞 (HSC)结缔组织生长因子 (CTGF)基因表达的抑制作用。方法针对大鼠CTGFmRNA 4 83、885和 94 6位点化学合成 3对 2 1核苷酸 (nt)siRNA ,分别以 5 0、10 0、2 0 0nmol/L浓度转染HSCT6 ,以空白及转染非特异siRNA作为对照 ,应用RT PCR检测CTGFmRNA表达 ,筛选出抑制效率最高的siRNA及其浓度 ;再转染HSCT6 ,抽提孵育 2 4、4 8、72h细胞总RNA及蛋白质 ,应用RT PCR和Westernblot检测CTGFmRNA及蛋白质表达。结果与对照相比 ,转染siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平明显降低 ,siRNA抑制效率在 5 0 ～2 0 0nmol/L范围呈浓度依赖性增高 ,以 4 83siRNA 2 0 0nmol/L最显著 ,转染非特异siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平无明显变化 ;转染 4 83siRNA的HSCT6细胞 2 4 4 8、72hCTGFmRNA分别下调 (91± 2 ) %、(6 5± 3) % (P均 <0 .0 1)和 (10± 7) % (P =0 .0 6 34) ,蛋白分别下调 (86± 5 ) %、(94± 4 ) %和 (4 2± 9) % (P均 <0 .0 1)。结论化学合成 4 83siRNA能高效抑制HSC的CTGF基因表达 ,有效阻抑时间达 72h。

PPAR-γ激活对血管平滑肌细胞外基质释放及结缔组织生长因子表达的影响

目的观察PPAR-γ激活对血管紧张素Ⅱ诱导的体外培养条件下大鼠血管平滑肌(VSMCs)的细胞外基质(ECM)释放及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法原代培养大鼠VSMCs,用不同浓度PPAR-γ激动剂rosiglitzone和/或抑制剂GW9662、BADGE预处理后,加入0.1μmol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激24h。比色法检测各组细胞培养液中羟脯氨酸含量,实时荧光定量RT-PCR方法检测各组三型胶原(ColⅢ)、层粘连蛋白(FN)及CTGFmRNA表达,Western blotting检测各组CTGF、PPAR-γ蛋白表达情况,基于ELISA的DNA-binding检测各组PPAR-γ活性。结果 AngⅡ可增加VSMCs PPAR-γ表达,但明显抑制其活性(P<0.05,vs.Control),PPAR-γ激动剂rosiglitazone可显著增加PPAR-γ蛋白表达及活化(P<0.05,vs.AngⅡ)。rosiglitazone可降低细胞培养液中羟脯氨酸含量,下调VSMCs中ColⅢ、FN、CTGF mRNA表达,抑制CTGF蛋白表达,而其他PPAR-γ激动剂(pioglitazone、15-d-PGJ2)均有相似作用,PPAR-γ拮抗剂GW9662及BADGE可拮抗这一作用。结论在VSMCs中,PPAR-γ激活可抑制AngⅡ诱导的CTGF表达,同时抑制ECM沉积。提示PPAR-γ可能在血管纤维化中起重要作用。

结缔组织生长因子的分泌表达及ELISA检测法的建立

目的 制备结缔组织生长因子 (CTGF)抗原 ,建立ELISA检测方法。方法 从血管内皮细胞中提取总RNA ,逆转录合成cDNA ,设计特异性引物 ,通过PCR方法扩增CTGFC区 2 4 2～ 349位氨基酸基因 ,插入噬菌体包膜蛋白基因Ⅲ的上游 ,制备CTGF融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔 ,获得抗体 ,抗体纯化后标记HRP ,建立ELISA。结果 成功克隆CTGFC区基因 ,插入表达载体经IPTG诱导后获得分子量为 2 5 0 0 0的融合蛋白 ,免疫学检测证实为CTGF。所得抗体用HRP标记。建立的ELISA法检测灵敏度为 2ng/ml,批内及批间平均变异系数为 5 .4 %和 7.5 % ,平均回收率为 10 4 .2 %。血红蛋白浓度在 0～ 5 0mmol/L ,总胆红素在 0～ 15 0 μmol/L ,三酰甘油在 0～ 2 .0mmol/L对测定结果无影响。 2例慢性乙型肝炎病人血标本 ,5例糖尿病肾病、3例肾功能衰竭、3例慢性肾炎尿标本为阳性。结论 CTGF可以作为判断纤维化发生、进展及预后的一个新指标。CTGFELISA检测方法的成功建立 。

依那普利和丹芪合剂对糖尿病大鼠肾组织结缔组织生长因子表达的影响

目的:探讨依那普利和丹芪合剂对糖尿病大鼠肾组织结缔组织生长因子(CTGF)及蛋白激酶Cα(PKCα)表达的影响。方法:SD大鼠随机分为正常组(A组)、糖尿病组(B组)、糖尿病丹芪合剂组(C组)和依那普利组(D组)。尾静脉注射链脲佐菌素复制糖尿病模型。用免疫组化检测肾组织CTGF、PKCα、纤维连接蛋白(FN);Western印迹法检测肾组织CTGF蛋白水平;光镜观察肾组织的形态结构变化;生化方法检测尿蛋白、血糖、血脂和血肌酐。结果:12周后,药物处理的糖尿病大鼠肾组织CTGF、PKCα、FN表达高于正常组,但低于未处理的糖尿病组,血肌酐和尿蛋白水平较低,肾脏病理改变较轻,同时CTGF与PKCα和FN及肾脏指数和肾功能呈显著正相关。丹芪合剂组动物与未处理组相比,血脂水平较低。结论:依那普利和丹芪合剂可能通过PKC信号通路而抑制CTGF的表达,使FN的生成减少,从而对糖尿病大鼠肾脏起保护作用。

结缔组织生长因子的研究进展

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是即刻早期基因CCN家族成员。CTGF在人类多种组织器官中广泛表达,即发育与分化、雌性生殖系统、血管生成、伤口修复、纤维变性病变、炎性病变、肿瘤的发生发展、骨的形成与修复等多种生物学过程中起重要的作用。在机体内几乎全部类型的成纤维细胞中诱导CTGF表达的主要因子为TGF-β。TGF-β可通过多种信号途径诱导CTGF表达,主要有4种途径,其中最重要的是Smad介导的TGF-β1途径。CTGF的生物学功能与作用机制非常复杂,本文将对CTGF的基本结构、表达调控、影响因素以及生物学功能研究进展进行综述,为CTGF全面解析奠定基础。

慢性阻塞性肺病大鼠结缔组织生长因子的表达

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)在慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠模型的表达以及与肺结构重塑的相关性。方法 通过烟熏及气管内注入脂多糖法建立COPD大鼠模型。RT-PCR和免疫组织化学方法检测大鼠肺组织中CTGF mRNA与蛋白表达水平;天狼猩红偏振光法观察大鼠Ⅰ、Ⅲ胶原沉积情况,并对大鼠肺组织作病理形态学分析。结果 CTGF mRNA早期出现高峰,后期出现下降并保持在一较高水平。对照组、7 d组大鼠肺组织未检测到CTGF蛋白表达,从14 d组开始CTGF表达逐步增加。结论 CTGF在COPD间质纤维化的形成与进展过程中起着重要作用。

病理性瘢痕中结缔组织生长因子的免疫电镜观察

目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)在病理性瘢痕组织中的表达定位,以探讨其在病理性瘢痕中的作用及与病理性瘢痕形成的关系。方法:分别留取正常皮肤2例、浅表性瘢痕3例、增生性瘢痕、增生性瘢痕边缘正常皮肤、瘢痕疙瘩及瘢痕疙瘩边缘正常皮肤各5例组织标本,用特异性抗体作为标记物,用胶体金作示踪物进行免疫电镜观察,观察标记物所在位置,以了解在不同组织中表达水平的差异性。结果:CTGF在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩边缘正常皮肤中的表达均明显高于正常皮肤、浅表性瘢痕及增生性瘢痕边缘正常皮肤。免疫电镜标记显示成纤维细胞细胞超微结构清晰,金颗粒呈团状、点灶状分布,特异性强,CTGF蛋白阳性标记主要位于粗面内质网,粗面内质网核糖体、胶原纤维、细胞外基质、桥粒连接、常染色质等部位也有表达。结论:CTGF与病理性瘢痕的形成有相关性,在其发病过程中可能发挥重要作用。

转化生长因子-β刺激人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子的表达

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RTP-CR)和蛋白印迹技术,观察TGF-β1对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CTGFmRNA及其蛋白质表达的影响,同时观察肾小管上皮细胞形态改变。结果:HK2细胞有基础量的CTGFmRNA和蛋白质分子表达,在TGF-β1刺激下,其表达量显著增加,经不同浓度TGF-β1干预24h后,CTGFmRNA表达量明显升高,且呈剂量依赖性。1ng/mlTGF-β1刺激时,CTGFmRNA表达量开始显著增加,5ng/ml时达到高峰,10ng/ml时略有下降,CTGFmRNA表达量分别为对照组的2.40倍,3.34倍和2.73倍(P<0.05)。CTGFmRNA表达量呈时间依赖效应。TGF-β1(5ng/ml)干预30min后,CTGFmRNA表达量开始呈现增加趋势,为对照组的1.48倍(P>0.05),2h后出现显著差异,为对照组的2.14倍(P<0.05);CTGFmRNA表达量在24h达到高峰,持续至36h,分别为对照组的3.19倍和2.75倍(P<0.005);0.5ng/mlTGF-β1刺激时,CTGF蛋白表达量略有增加,5ng/ml时达到高峰,10ng/ml时略有下降。在TGF-β1(5ng/ml)干预下,HK2细胞由立方形铺路石样逐渐转变为长梭形长条样,免疫荧光检测见梭形细胞胞浆中有大量αSMA表达。大部分细胞转分化的时间(72h)明显晚于CTGFmRNA?

转化生长因子β_1诱导人肾小管上皮细胞表达结缔组织生长因子

目的 研究转化生长因子 β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)对人肾小管上皮细胞 (humanproximaltubularep ithelialcells ,HTECs)表达结缔组织生长因子 (connectivetissuegrowthfactor ,CTGF)的影响。方法 体外培养的HTEC被根据随机数字表分为 3组 :对照组 (C组 ) :无血清培养基 (freeserummedium ,FSM)培养 ;TGFβ1a和TGFβ1b组 (Ta 组和Tb 组 ) :分别用含不同浓度TGFβ1(Ta 组 :2 0ng/ml,Tb 组 :40ng/ml)的FSM培养 ,96h后 ,分别用RT PCR和免疫组化方法检测HTEC表达CT GFmRNA和蛋白。结果 ①C组 :CTGFmRNA和蛋白表达为阴性 ;②Tb 组和Ta 组 :CTGFmRNA和蛋白表达皆呈阳性。Tb 组和Ta 组相比 ,CTGF的mRNA和蛋白表达量皆显著增加 (P <0 .0 1)。结论 TGFβ1能呈剂量依赖性地诱导HTEC合成CTGF。