基于类器官培养的艰难梭菌毒素B损伤结肠上皮机制的初步研究

目的 建立艰难梭菌感染结肠类器官模型,对艰难梭菌毒素B(TcdB)损伤小鼠结肠上皮的作用及可能机制进行初步研究。方法 处死6~8周龄C57BL/6小鼠,取结肠标本,分离、收集结肠隐窝,以基质胶包埋后加入培养基,显微镜下观察记录生长情况;在巨大芽孢杆菌中表达重组艰难梭菌毒素B(rTcdB)蛋白,经镍柱纯化后加入结肠类器官体系继续培养,观察类器官生长情况并检测干性基因表达量变化,转录组测序分析。结果 5pmol/L rTcdB作用12 h即可致结肠类器官生长缓慢及部分死亡,干性基因Lgr5、Axin2、Bmi1表达较对照组显著上调。RNA-seq测序结果显示毒素作用组较对照组差异基因有3 140个,其中上调基因有1 936个,下调基因有1 204个。Gene Ontology富集分析显示损伤组差异基因主要富集的生物过程通路分别有低氧应答和对β干扰素、γ干扰素的细胞应答。同时蛋白质互作网络(Protein-Protein Interaction Networks, PPI)筛选出9个关键基因,其中的IFIT3、IFIT1、GBP3和GBP2的编码基因也参与了α/β干扰素、γ干扰素的细胞应答通路。京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析结果表明有47条通路差异显著富集,包括花生四烯酸代谢通路和Wnt信号通路等。结论 TcdB可能通过调节干性基因表达,增强低氧应答通路,减弱α/β干扰素、γ干扰素的细胞应答通路,调节花生四烯酸代谢通路和Wnt信号通路等介导损伤结肠上皮细胞。