应用CRISPR/Cas9基因编辑系统对HEK293细胞系TSC1基因稳定敲除效果的实验鉴定

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas9)基因编辑系统在HEK293细胞系中对TSC1基因稳定敲除,并对其敲除效果进行鉴定。方法根据TSC1基因的序列设计sgRNA,将sgRNA克隆到载体lentilCRISPRv2上,将连接产物转化至Stbl3感受态细胞,对菌液进行测序鉴定。将鉴定成功的lentiCRISPRV2-sgTSC1质粒转染至HEK293细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,挑选单细胞克隆进行PCR鉴定,选取条带单一的细胞株用Western blot鉴定TSC1基因的表达。结果成功构建lentiCRISPRV2-sgTSC1-1/2重组质粒,并利用该质粒完成对TCS1基因的定点切割,Western blot结果显示细胞中无TSC1表达。结论用CRISPR/Cas9系统成功构建TSC1基因敲除的稳定细胞株,为后续实验奠定了基础。

结节性硬化症临床研究进展

结节性硬化(tuberous sclerosis complex,TSC)是一种常染色显性遗传皮肤神经综合征,该病临床表现复杂多样,多以皮损、脑内结节、心脏横纹肌瘤、肺血管淋巴瘤、肾血管平滑肌瘤等全身多个器官出现错构瘤病变及神经精神症状为主.目前研究发现结节性硬化症基因1、2(TSC1、TSC2)是其致病基因,该文就TSC发病机制及最新研究综述如下.

食源性肥胖大鼠下丘脑Tsc1启动子区甲基化率、mTOR表达变化

目的观察食源性肥胖大鼠下丘脑结节性硬化症基因1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)启动子区甲基化率及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达。方法 16只雄性SD大鼠分为高脂喂养组和基础饲料喂养组(对照组),每组8只,共喂养12周。测定两组大鼠体质量、腹腔脂肪量、腹腔脂肪/体质量比值,采用重亚硫酸盐的测序法检测Tsc1启动子甲基化,RT-PCR、Western blot分别检测mTOR mRNA和蛋白表达。结果高脂组大鼠体质量、腹腔脂肪量、腹腔脂肪/体质量比均高于对照组(P<0.05)。两组大鼠下丘脑Tsc1启动子区均有11个位点可被甲基化,食源性肥胖组甲基化率(94.50%±4.66%)高于对照组(86.60%±3.49%,P<0.002),mTOR mRNA和蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论食源性肥胖大鼠下丘脑Tsc1基因启动子甲基化率增加,其下游基因mTOR表达上调,可能参与了肥胖的发生。

电针通过下丘脑TSC1-mTOR信号通路减轻肥胖大鼠体重的机制研究

目的探讨电针通过下丘脑结节性硬化症基因1(tuberous sclerosis complex 1,TSC1)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路减轻食源性肥胖(diet-induced obesity,DIO)大鼠体重的机制。方法 40只雄性SD大鼠随机分为造模组(30只)和正常组(10只)。采用高脂饲料饲养12周制备食源性肥胖大鼠模型,将造模成功的19只大鼠随机分为模型组(9只)和针刺组(10只)。针刺组选天枢、三阴交、中脘、足三里穴进行治疗,每天1次,每周连续针刺5天,休息2天,治疗4周。模型组和正常组不予以干预治疗。观察各组大鼠体重变化;采用重亚硫酸盐的测序法检测TSC1启动子甲基化程度;采用RT-PCR检测m TOR基因表达。结果与本组治疗前比较,针刺组大鼠体重下降(P<0.05);与正常组比较,治疗后模型组和针刺组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠下丘脑TSC1启动子甲基化率(94.0±4.5)%高于正常组的(87.0±3.6)%,针刺组TSC1启动子甲基化率(87.4±3.9)%低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠下丘脑m TOR基因表达(1.84±0.51)高于正常组(1.02±0.22),针刺组(1.46±0.29)低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论电针可通过下调下丘脑TSC1启动子甲基化程度,调节m TOR基因表达减轻DIO大鼠体重。