绛红色小单孢菌G1008接合转移体系的构建

目的构建绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)的接合转移体系,并对该体系进行优化。方法以绛红色小单孢菌G1008染色体DNA为模板,经PCR扩增甲基化酶基因gntK的上下游序列各2000bp左右作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因作为筛选标记插入两交换臂之间。以温敏型质粒pKC1139作为基本载体,构建重组质粒pFD306。借助接合转移技术,将该质粒导入绛红色小单孢菌G1008。结果经抗性筛选,得到一株阳性菌株,命名为GK1008,经PCR鉴定和测序,验证了重组质粒已整合到染色体上。GK1008菌株对红霉素和安普霉素的抗性均超过500μg/mL。结论绛红色小单孢菌接合转移体系的构建达到了预期目的,并实现了对该体系的优化,这为其它小单孢菌的分子遗传学操作提供了借鉴。

影响绛红色小单孢菌(Micromonospora Purpurea)S-1212孢子萌发的几个主要因子的研究

影响绛红色小单孢菌孢子同步萌发的因子有营养、p H、温度、密度、溶氧等 ,试验结果表明 :p H6 .7～ 6 .8、温度 36℃、孢子密度以 1× 1 0 9个 / ml为宜 ,溶氧及一些生长因子 ,特别是甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸 ,对该菌孢子萌发也是相当重要的因子 .

绛红色小单孢菌生长中细胞结构变化的研究

绛红色小单孢菌生长中细胞结构变化的研究管玉霞，黄宗平（厦门大学细胞生物学研究室，厦门３６１００５）绛红色小单孢菌生长过程中菌体形态电镜观察已有报道￣［１］。但该菌在生长中细胞结构有何变化，这种变化与产抗有什么关系，迄今尚未见报道。本文旨在用扫描电子显...

绛红色小单孢菌发酵过程中细胞形态结构变化

对庆大霉素产生菌──绛红色小单孢菌发酵中细胞形态、结构变化进行了研究。扫描电镜观察，发现生长期细胞表面布满微小颗粒，生产期则形成较大突起。透射电镜观察到不同培养期细胞膜、细胞壁、细胞质、核区等超微结构都有明显变化。生长期细胞膜弯曲，胞壁薄厚不匀，核区、核糖体等清晰；生产期细胞膜与胞壁平行，胞壁变薄，出现横隔和间体。发现绛红色小单孢菌在生长期、生产期均形成横隔，提出在液体培养基中该菌以横隔方式进行繁殖。

绛红色小单孢噬菌体MPh1在大肠杆菌中有启动子功能的DNA片段的克隆及顺序测定

从绛红色小单孢噬菌体Ｍｐｈ１ＤＮＡ中，用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＧＡ４６克隆到在大肠杆菌中具有启动子功能的ＤＮＡ片段，筛选到的启动子功能片段具有抗四环素能力达１００μｇ／ｍｌ以上。对这些活性片段进行分子杂交，证明确实来自绛红色小单孢噬菌体Ｍｎｈ１。在此基础上，对其中一个２５０ｂｐ长的片段从克隆位点的一端进行了ＤＮＡ序列分析，其结构类似于大肠杆菌启动子。并进行了Ｇ＋Ｃ百分比的统计和限制性内切酶位点分析。

绛红色小单孢菌噬菌体启动子在大肠杆菌中高水平表达

绛红色小单孢菌噬菌体启动子在大肠杆菌中高水平表达福建中医药研究院张恩平复旦大学遗传学研究所陈孝康启动子结构与功能的研究对于基因工程中产物的高水平表达具有重要意义。放线菌启动子，有的既可在放线菌表达，也可在大肠杆菌表达［１］。已克隆的放线菌噬菌体的启动...

庆大霉素产生菌绛红色小单孢噬菌体防治办法的评价

庆大霉素产生菌绛红色小单孢噬菌体防治办法的评价张菊英（福州抗生素总厂，福州３５０００２）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｔｈｅｐｈａｇｅｏｆｇｅｎｔａｍｉｃｉｎｐｒｏｄｕｃｅｒ，...

绛红色小单孢菌噬菌体防治办法的评价

庆大霉素产生菌—绛红色小单孢在工业生产时污染了噬菌体，采取综合防治的办法，能制服噬菌体，可以不停产或转产，至今已保持4年没有发生污染，表明此办法行之有效。

N-乙酰氨基葡萄糖对绛红小单孢菌合成庆大霉素的影响

研究了N-乙酰氨基葡萄糖对绛红小单孢菌产素的影响,实验探索了N-乙酰氨基葡萄糖添加工艺,在250mL摇瓶发酵过程中培养48h,60h分别添加0.05%,0.15%N-乙酰氨基葡萄糖可使庆大霉素生测效价达2 030U/mL,较对照1 228U/mL提高了65%以上(三次平均基本一致);5L发酵罐试产三批次发酵终结,生测效价平均为1 727U/mL(厡工艺1 097U/mL)提高了57%,效果十分明显.同时测定了发酵过程中菌体代谢各种参数的变化,证明了N-乙酰氨基葡萄糖在绛红小单孢菌生物合成中的促进作用.本方法操作简单,基本不改变原工艺,生产成本低廉,对提高庆大霉素产量效果非常明显.

庆大霉素生物合成基因genB4的研究

以庆大霉素生物合成基因簇为模版,构建了genB4基因阻断质粒pGB403.经接合转移导入绛红色小单孢菌G1008,得到一株genB4基因缺失工程菌GB4408.对菌株GB4408的发酵产物进行了TLC、HPLC和MS分析,结果表明GB4408不再合成庆大霉素C族组分,而是积累中间代谢产物G418、西索霉素和威大霉素,阻断了从西索霉素到庆大霉素C1a的转化以及从威大霉素到庆大霉素C2的转化,这可能是genB4基因参与了庆大霉素绛红糖胺C4′和C5′的双脱氢作用.据此推论,在菌株GbK(△genK)基础上敲除了genB4基因,并成功获得一株主产西索霉素的工程菌GbKB4,进一步验证了genB4的功能.

庆大霉素生物合成基因genD1的研究

为研究genD1基因功能,在绛红色小单孢菌GK1101(Δgen K)上构建genD1基因缺失工程菌并分析其代谢产物组分变化。首先构建用于genD1基因框内敲除的同源重组质粒pGD14,经接合转移导入绛红色小单孢菌GK1101,经影印筛选获得genD1缺失工程菌GD1989。再发酵并提取其代谢产物,采用质谱法等检测代谢产物。结果表明,工程菌GD1989不再合成庆大霉素C1a和C2b,主要积累庆大霉素A。对工程菌GD1989喂养庆大霉素X2的发酵产物经检测含有庆大霉素C1a、C2b和JI-20A。genD1基因失活导致庆大霉素生物合成代谢流中断,说明genD1基因负责加洛糖胺C-4″位的甲基化。

同工异源酶基因forp与genp异源表达的研究

来自绛红色小单孢菌G1008的genp与来自橄榄星小单孢菌FOM808的forp,均参与3’,4’-双脱羟基,2个基因属于同工异源酶基因.应用同源重组原理,实现forp替换genp,探索同工异源酶基因异源表达的可能性.以温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建同源重组质粒pFP4.经接合转移将载体导入到G1008基因组中,利用影印筛选和PCR验证的方法,获得基因重组工程菌FTP2.提取工程菌次级代谢产物,经TLC和MS分析.结果表明,工程菌仍然可以产生庆大霉素C组分.forp基因的功能得到了体现,外源基因forp实现了异源表达,进一步证实forp是负责参与3’,4’-双脱羟基的功能基因.

耐高浓度庆大霉素菌种的选育

以庆大霉素为筛选剂 ,对庆大霉素产生菌绛红色小单孢菌进行选育 ,从而获得了对庆大霉素具有耐受性的新菌种 ,效价提高 17.4% ,产品全部符合中国药典 1995版标准。

庆大霉素生物合成基因genY的研究

以绛红色小单孢菌G1008基因组为模板,构建genY基因缺失的同源重组质粒pFY103,经接合转移导入绛红色小单孢菌G1008和GK1101(△genK),筛选获得genY基因缺失工程菌GY105(△genY)和工程菌GKY205(△genK+genY),发酵、提取并经质谱检测分析代谢产物.结果表明,工程菌GY105和GKY205主要积累西索米星、庆大霉素C1a和C2b.证明genY基因缺失阻断了庆大霉素X2到G418的转化,说明genY基因参与庆大霉素生物合成过程中绛红糖胺C-6’位甲基化.

庆大霉素发酵工艺的研究

目的通过对庆大霉素发酵条件的优化,提高发酵生产的能力。方法以绛红色小单孢菌2-25为对象,通过单因素试验和四因素三水平(4×3)正交试验筛选出了菌株2-25的最佳培养基配方及培养条件。结果该菌种的最佳发酵条件:5.0%玉米淀粉,3.0%黄豆饼粉,0.6%蛋白胨,0.15%硝酸钾,在33℃、pH 7.8、接种量25%,培养84h,产品质量符合中国药典2005版(CP2005)、美国药典28(USP28)。结论优化发酵条件后菌株2-25发酵水平明显提高。

庆大霉素产生菌原生质体融合高产株与发酵罐试产的研究

对庆大霉素产生菌绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)原生质体分别用硫酸二乙酯(DES)和紫外线(uv)进行诱变、融合,用庆大霉素进行抗性筛选、再生后得到高产菌株;经摇瓶连续10批次发酵考查,平均发酵单位在2200±U/ml;又经5L发酵罐连续发酵考查7批次,产量平均1900±U/ml。产品质量符合药典。

庆大霉素生物合成基因genA的功能

【目的】在绛红色小单孢菌G1008(Micromonospora purpurea G1008)上构建genA基因缺失工程菌,通过分析其次级代谢产物的变化,推测genA基因功能。【方法】构建用于gen A基因框内敲除的质粒pAB103,经接合转移导入绛红色小单孢菌G1008,安普抗性及PCR扩增筛选获得genA缺失工程菌GA1048。【结果】与出发菌G1008相比,工程菌GA1048不再合成庆大霉素C族组分,主要积累中间代谢产物庆大霉素A2。【结论】genA基因失活导致庆大霉素生物合成代谢流中断,暗示gen A基因参与加洛糖胺C-3″位的氨甲基化。