川续断皂苷B抑制线粒体E3泛素连接酶1减轻缺血性中风大鼠脑损伤

目的探讨川续断皂苷B对缺血性脑卒中的作用及机制。方法SD大鼠和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞分别给予左脑缺血2 h、再灌注24 h和低氧8 h、复氧24 h的处理,在动物水平和离体水平建立缺血性脑卒中模型并给予不同剂量的川续断皂苷B。通过神经功能学评分、TTC染色、TUNEL染色检测大鼠脑损伤以及运用MTS法、LDH细胞毒性释放实验、流式细胞术等手段检测PC12细胞损伤,并运用Western印迹法对相关蛋白水平进行检测。运用MOE分子对接软件对川续断皂苷B和线粒体E3泛素连接酶1(Mul1)进行分子相互作用预测。结果与假手术组相比,模型组大鼠发生了严重脑损伤(神经功能学评分升高、脑梗死灶出现、TUNEL阳性细胞增多,胱天蛋白酶3活性增强、ATP产量减少),同时Mul1和动力相关蛋白1(Drp1)水平升高,mitofusin2(Mfn2)蛋白水平降低。川续断皂苷B能够减弱脑损伤并逆转Mul1,Drp1和Mfn2的蛋白水平改变。离体水平结果一致,与对照组相比,低氧处理的PC12细胞出现了细胞损伤(细胞PI阳性率从5%左右增加至35%左右、胱天蛋白酶3活性增强、LDH释放率增加)和线粒体功能下降(线粒体膜电位ΔΨm和ATP产量下降,ROS产量和线粒体分裂增加),同时Mul1和Drp1表达上调,Mfn2蛋白水平降低,以上现象能被川续断皂苷B抑制。MOE分子对接结果显示,川续断皂苷B可能和Mul1294位Asp、303位和320位Val和318位Gly存在相互作用。结论川续断皂苷B能够通过抑制Mul1改善线粒体功能保护大鼠脑组织免于缺血性损伤。

液质联用技术联合化学计量法分析比较续断盐制前后质量差异

目的通过超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱技术(UPLC-Q-TOF-MS/MS)鉴定续断DipsaciRadix盐制前后化学成分,并寻找其差异性成分。方法液相采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5.0μm),流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈,梯度洗脱,柱温25℃,体积流量0.8 m L/min,检测波长215 nm。质谱采用电喷雾离子源负离子模式采集样品数据,扫描范围为m/z100~2000。根据质谱信息,结合碎片裂解规律,与数据库、文献及对照品的比对对检测到的化学成分进行综合鉴定;通过主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)对比分析续断盐制前后的质量差异。结果共鉴定和推测出生续断与盐续断中54种共有化学成分,主要包括皂苷类、环烯醚萜类和酚酸类化合物等。通过多元统计分析表明,生续断和盐续断在PCA模型中能清晰地分为2类,OPLS-DA模型筛选得到12个主要差异成分,分别为马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、马钱苷、异绿原酸B、异绿原酸A、茶茱萸苷、异绿原酸C、续断苷B、续断苷A、川续断皂苷Ⅵ、木通皂苷St(b)。结论建立了生续断与盐续断化学成分定性分析的方法,初步筛选了影响续断盐制前后质量变化的主要化合物,为后续对续断药效物质基础的研究提供了依据,有助于提高续断的质量控制水平。

HPLC法同时测定固肾安胎丸中7种成分含量

目的:建立HPLC梯度洗脱法同时测定固肾安胎丸中2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、川续断皂苷Ⅵ、续断苷A和续断苷B含量。方法:采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱,流速为1.0 ml·min-1,柱温为25℃,检测波长分别为320 nm(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)、230 nm(芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷)和212 nm(川续断皂苷Ⅵ、续断苷A和续断苷B)。结果:2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、川续断皂苷Ⅵ、续断苷A和续断苷B质量浓度分别在2.98~74.50,5.66~141.50,9.88~247.00,0.89~22.25,10.77~269.25,1.99~49.75,1.06~26.50μg·ml-1范围内线性关系良好(r≥0.9993),平均加样回收率分别为97.77%,98.03%,99.22%,98.49%,100.03%,97.86%,96.89%,RSD分别为1.51%,1.11%,0.86%,1.18%,0.67%,1.29%,1.08%(n=9)。结论:该方法操作简便、重复性好,可用于固肾安胎丸中多指标性成分的质量控制。