正交设计探讨续苓健骨方对快速骨丢失模型大鼠的组方优化研究

目的 通过正交设计观察续苓健骨方中的药物对卵巢切除术(ovariectomy, OVX)模型大鼠骨密度、骨微结构和骨代谢影响的主次作用,并探讨疗效较佳优化组别的潜在作用机制。方法 大鼠随机分为假手术组、模型组、续苓健骨方组、优化1组、优化2组、优化3组、优化4组、优化5组、优化6组、优化7组和优化8组,每组10只,采用OVX制备大鼠快速骨丢失模型,连续灌胃12周后取材备检。双能X线骨密度仪检测胫骨近端骨密度,micro-CT检测胫骨微观结构,ELISA检测血清骨吸收金指标CTX和骨形成金指标PINP的含量,Real-time PCR和Western blot检测股骨OPG、RANKL mRNA和蛋白的表达水平。结果 续苓健骨方组、优化4组、6组和7组骨密度均显著升高(P<0.05),优化4和7组Tb.N和BV/TV显著升高(P<0.001),续苓健骨方组和优化1~8组血清CTX、PINP均不同程度降低,续苓健骨方组和优化7组OPG mRNA和蛋白表达水平显著升高、RANKL mRNA和蛋白表达水平显著降低。结论 优化4组、6组和7组是治疗效果较好的组别,可通过调控OPG/RANKL发挥抗骨质疏松作用,续断、骨碎补、女贞子、红花和川芎是续苓健骨方取效的主要有效药物。

基于HIF-1α/VEGF通路探讨续苓健骨方对去卵巢大鼠骨代谢和局部血管生成的影响

目的 基于低氧诱导因子-1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)通路探讨续苓健骨方对去卵巢大鼠骨代谢和局部血管生成的影响。方法 将24只3月龄大鼠随机分为假手术组、模型组、续苓组和雌二醇组,每组6只。假手术组大鼠仅摘除双侧卵巢周围部分脂肪,其余3组均摘除双侧卵巢。摘除1周后,续苓组按体质量1 mL/(100 g·d)灌胃含生药浓度1.5 g/mL续苓健骨方药液,雌二醇组按体质量1 mL/(100 g·d)灌胃0.0125 mg/mL雌二醇药液,假手术组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,每日1次。干预12周后检测4组大鼠左胫骨近端骨密度、左股骨远端骨小梁面积百分比(Tb.Ar%)、骨小梁宽度(Tb.Wi)、骨小梁间距(Tb.Sp)以及血清雌二醇(E_(2))、Ⅰ型前胶原氨基端原肽(P1NP)、Ⅰ型胶原交联C末端肽(S-CTX)水平,免疫组化法检测4组大鼠左股骨远端分化决定簇抗原31(CD31)、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平。结果 与假手术组比较,模型组左胫骨近端骨密度下降(P<0.05),左股骨远端Tb.Wi变化无统计学意义(P>0.05),Tb.Ar%降低,Tb.Sp变大,血清E_(2)、P1NP水平降低,S-CTX水平上升,左股骨远端HIF-1α、VEGF蛋白表达水平显著下降(P均<0.05);与模型组比较,续苓组、雌二醇组左胫骨近端骨密度增高(P<0.05),左股骨远端Tb.Wi变化无统计学意义(P>0.05),Tb.Ar%增高,Tb.Sp缩小,血清E_(2)、P1NP水平升高,续苓组S-CTX水平下降(P均<0.05),续苓组和雌二醇组大鼠左股骨远端CD31、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平均显著增高(P均<0.05);续苓组与雌二醇组比较,上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 续苓健骨方能上调股骨远端骨组织HIF-1α/VEGF表达,促进血管生成及骨形成,从而稳定骨代谢,减少去卵巢大鼠的骨丢失。

阿法骨化醇片结合续苓健骨颗粒对骨质疏松症患者骨密度与血清钙磷指标的影响

目的:探究阿法骨化醇片结合续苓健骨颗粒对骨质疏松症患者骨密度与血清钙磷指标的影响。方法:选取我院2022年3月至2022年6月期间收治的114例骨质疏松症患者随机分为对照组(n=57,予以阿法骨化醇片0.5 mg口服)、观察组(n=57,口服阿法骨化醇片0.5μg、续苓健骨颗粒一袋),治疗1 m后对比临床疗效,治疗1 m后对比临床疗效,同时采用酶联免疫分析方法测定I型原胶原N端前肽(Type I procollagen N-terminal propeptide,PINP)、I型胶原交联C-末端肽(C-terminal peptides,CTX)、血清碱性磷酸酶(Alka line phosphatase,ALP)的水平,X线骨密度测定器测量骨密度值,生化法检测血清钙、磷的水平。结果:治疗后观察组临床总有效率明显高于对照组(P<0.05);观察组骨代谢水平较对照组改善明显,骨密度T值(T-score)、血清钙磷较对照组高(P<0.05);两组不良反应发生率比较无差异(P>0.05)。结论:阿法骨化醇片、续苓健骨颗粒的联合作用效果更明显,且安全可靠,利于调节患者骨代谢、血清钙磷水平,增加骨密度数值。

续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度及OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的研究续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度的作用及其机制。方法将SD雌性大鼠去卵巢造骨质疏松模型,随机分组:钙尔奇D组、续苓健骨方组和骨质疏松模型组,佐以假手术组对照,给药12周后取材,检测左胫骨骨密度,Elisa方法检测血清骨碱性磷酸酶(BALP)水平,Western blot法测OPG和RANKL蛋白表达。结果(1)续苓健骨方组骨密度均明显高于其它3组,组间比较有统计学意义(与钙尔奇D组P<0.05,与假手术组P<0.01,与模型组P<0.000)。(2)续苓健骨方组BALP水平明显高于模型组,两组比较有统计学意义,P<0.01,但与假手术组、钙尔奇D组比较无显著性差异,P>0.05。(3)续苓健骨方组OPG蛋白表达水平明显高于模型组,比较有统计学意义,P<0.05,RNAKL蛋白表达水平明显低于模型组,比较有统计学意义,P<0.01。模型组RANKL蛋白表达明显高于假手术组,P<0.05。结论续苓健骨方能显著提高骨质疏松模型大鼠的骨密度,其机制与上调OPG、下调RNAKL蛋白表达有关。

续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠血液钙磷代谢的影响

目的研究续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度、骨微结构和血液钙磷代谢的影响。方法将40只6月龄雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、续苓健骨方组[12.71 g/(kg·d)]和碳酸钙组[104.19 mg/(kg·d)],假手术组仅切除卵巢周围脂肪,其余组行双侧卵巢切除术后建立骨质疏松模型。药物干预12周后取材,通过双能X线骨密度仪检测左侧胫骨骨密度,经Masson染色观察右侧胫骨组织显微结构,生化检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、血钙和血磷水平。结果与假手术组相比,模型组骨密度显著降低,骨小梁断裂稀疏、排列不规则,TRAP表达增加,血钙含量降低,血磷含量升高。与模型组相比,续苓健骨方组骨密度增加,骨小梁数量增加、排列较规则,TRAP表达降低,血钙含量升高,血磷含量降低。结论续苓健骨方可提高去卵巢骨质疏松大鼠胫骨骨密度并改善骨组织微结构,其机制可能与调控血钙磷代谢稳态有关。

续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞分化及增殖的影响

目的 探讨续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。 方法 制备续苓健骨汤含药血清,实验分为空白对照组、含药血清低剂量组、中剂量组和高剂量组。采用CCK-8法和流式细胞术检测续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的影响;碱性磷酸酶(ALP)活性测定MC3T3-E1细胞的成骨分化能力;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OC、Bmp2、Col1a1mRNA水平。 结果 与空白对照组比较,中、高剂量续苓健骨汤含药血清能促进 MC3T3-E1 细胞增殖、S期细胞比率和细胞增殖指数,并且呈现一定的剂量依赖性;同时中高剂量续苓健骨汤含药血清组能明显提高 MC3T3-E1 细胞ALP活性( P <0.01)和钙化能力( P <0.01),促进 Runx2、OC、Bmp2、Col1a1 mRNA的表达( P <0.05)。 结论 续苓健骨汤含药血清能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,并通过上调骨形成相关基因Runx2、OC、BMP2、Col1a1的表达水平,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。

续苓健骨颗粒治疗肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症的疗效及转录机制研究

目的探讨续苓健骨颗粒治疗肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症的临床疗效及转录组机制。方法选取肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症患者,随机分为续苓健骨颗粒试验组及骨化三醇对照组。观察两组中医证候积分、骨密度及安全性指标。取6例试验组患者治疗前、后的外周血进行转录组测序,另选6例健康组作为对照,筛选差异表达基因并行KEGG分析。结果完成病例:试验组27例,对照组27例。试验组中医证候疗效总有效率为96.30%,显著优于对照组的77.78%(P<0.05)。治疗后两组中医证候积分、腰脊刺痛、下肢痿软等临床症状评分较治疗前均下降(P<0.05),但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组治疗前后骨密度比较差异无统计学意义(P>0.05),但均保持稳定或呈现上升趋势。两组均未出现严重不良反应。转录组测序:试验组治疗前、后有319个差异基因;试验组治疗前与健康组有598个差异基因,其中19个差异基因(包括FOSB、H4C2、RAMP3等)在治疗后其表达显著改变。KEGG分析结果表明,FOSB参与破骨细胞分化、IL-17信号通路。结论续苓健骨颗粒治疗绝经后骨质疏松症,能够显著改善临床症状,中医证候疗效优于骨化三醇,其作用机制可能与FOSB、RAMP3、H4C2基因及FOSB参与的破骨细胞分化、IL-17信号通路相关。

续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠miRNA表达谱的作用研究

目的通过分析骨质疏松症大鼠模型miRNA表达谱变化,探讨续苓健骨方治疗骨质疏松症的分子机制。方法建立去卵巢法骨质疏松模型大鼠12只,分为模型组6只、续苓健骨方组6只。假手术组6只为对照。造模1个月后,续苓健骨方灌胃12周,检测大鼠胫骨骨密度,检测腰椎miRNA表达谱,对差异表达的miRNAs进行生物信息学分析。结果与假手术组比较,模型组腰椎miRNAs 58条显著下调、97条显著上调;与模型组比较,续苓健骨方组腰椎miRNAs下调的50条显著上调、上调的60条显著下调;与假手术组比较,续苓健骨方组腰椎miRNAs仅8条有差异。生物信息学分析发现,差异miRNAs靶基因主要参与HIF-1、甲状腺激素、Hedgehog、GnRH、自噬、cAMP及MAPK等信号通路。结论建立了续苓健骨方治疗骨质疏松模型大鼠的miRNA表达谱;差异miRNAs可能通过调控HIF-1、甲状腺激素、Hedgehog、GnRH、自噬、cAMP及MAPK等信号通路参与续苓健骨方对骨质疏松大鼠的治疗过程。

续苓健骨方联合阿仑膦酸钠调控EphB4/EphrinB2双向通路对去卵巢骨质疏松大鼠的研究

目的观察续苓健骨方联合阿仑膦酸钠对去卵巢快速骨丢失模型大鼠骨密度、结构、骨代谢和EphB4/EphrinB2信号通路的影响,探讨其作用机制。方法50只雌性SD大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、续苓健骨方组、阿仑膦酸钠组和联合用药组,行双侧卵巢切除术制备模型;药物分别干预12周后取材,DXA检测股骨骨密度,HE染色观察胫骨组织显微结构,ELISA检测血清Ⅰ型胶原交联C末端肽(S-CTX)和Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)水平,Real-time PCR和Western blot检测腰椎EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白的表达水平。结果与假手术组相比,模型组骨密度显著降低(P<0.001),骨小梁稀疏并且排列紊乱,S-CTX和PINP含量均增高(P<0.01),骨组织EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.001)。与模型组相比,3个药物组骨密度均增高,其中以联合用药组最佳(P<0.001),骨小梁较密并且排列规则,S-CTX含量不同程度降低,PINP含量不同程度增高,EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白表达水平均增高。结论续苓健骨方联合阿仑膦酸钠起协同作用,可能通过激活EphB4/EphrinB2信号通路改善骨组织显微结构和血清骨代谢指标,从而提高大鼠骨密度起抗骨质疏松作用。

续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠肠道菌群结构和功能的影响

目的:研究续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠肠道菌群的组成及基因功能影响。方法:建立去卵巢骨质疏松大鼠模型,随机分为四组:假手术组、模型组、续苓健骨方组、雌激素组,每组6只。造模4周后,药物干预12周取材,双能X线骨密度仪小动物扫描模式检测大鼠胫骨骨密度,宏基因组全基因组测序技术检测大鼠肠道菌群的组成、结构及功能。结果:与假手术组相比,模型组大鼠胫骨骨密度显著降低(P 【0.01);与模型组比较,续苓健骨方组和雌激素组骨密度明显提高(P 【0.01);对不同组别肠道菌群的物种组成及丰度情况进行分析,在门、纲、目、科、属、种各个水平,组间差异有统计学意义(P 【0.001);LEfSe差异性分析结果显示,厚壁菌门、杆菌纲、乳酸杆菌目等菌种是骨质疏松症模型组大鼠肠道内关键差异菌群;与模型组比较,古菌门、甲烷杆菌纲目科、甲烷球菌属种是续苓健骨方组关键差异菌群;进一步对差异基因的KEGG功能注释结果统计并进行富集分析,在KEGG第一层级水平,各组大鼠肠道菌群基因注释到6大类生物代谢通路,其中注释到第一位的为新陈代谢通路;在KEGG第二层级水平,注释到的主要代谢通路包括:碳水化合物代谢、氨基酸代谢等,富集到的通路中60%属于在KEGG一级水平中的新陈代谢通路;对基因注释得到的功能丰度进行差异分析,续苓健骨方组与骨质疏松症组肠道菌群基因功能注释结果差异具有统计学意义,其中差异明显的代谢通路包括内分泌抵抗通路、ErbB信号通路、TGF-β信号通路等。结论:续苓健骨方在骨质疏松模型大鼠肠道菌群结构组成、多样性及生物代谢通路上具有调节作用,平衡肠道微生态稳态是续苓健骨方实现防治骨质疏松症作用的靶点之一。

续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度及骨生物力学的影响

目的：研究续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度、骨生物力学指标的影响。方法将40只SD雌性大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、钙尔奇D组和续苓健骨方组各10只。除假手术组外，其余各组制备骨质疏松模型。造模后30 d开始灌胃给药，钙尔奇D组大鼠灌胃钙尔奇D混悬液0.126 g/kg；续苓健骨方组灌胃续苓健骨方药液15 g/kg；假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水，1次/d。给药12周后取材。采用双能X射线检测左胫骨骨密度，三点弯曲法行骨生物力学检测。结果续苓健骨方组骨密度[（0.244±0.022）g/cm2比（0.195±0.017）g/cm2]较模型组增高（P＜0.01），且明显高于钙尔奇 D组[（0.244±0.022）g/cm2比（0.223±0.013）g/cm2]；续苓健骨方组断裂点荷载[（0.072±0.036）kN 比（0.041±0.015）kN]、应力[（843.754±428.722）N/mm2比（482.084±176.646）N/mm2]较模型组增高（P＜0.05）。结论续苓健骨方可提高骨质疏松模型大鼠的骨密度，改善骨生物力学性能。

续苓健骨方对骨质疏松症模型大鼠细胞核因子κB受体活化因子配体及骨保护素基因表达的影响

目的 研究续苓健骨方对骨质疏松症模型大鼠骨密度的影响及作用机制。方法 将50只SD雌性大鼠按随机数字表法分为假手术组，模型组，续苓健骨方低、中、高剂量组，每组10只。除假手术组外，其余各组大鼠行双侧卵巢切除术制备骨质疏松模型。造模后30 d开始灌胃给药，续苓健骨方低、中、高剂量组分别灌胃续苓健骨方药液7.5、15、30 g/kg；假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水，1次/d。给药12周后取材。采用双能X射线检测左胫骨骨密度；ELISA法检测大鼠血清雌激素酮、骨钙素水平；荧光定量PCR法检测大鼠腰椎骨保护素（osteoprotegerin, OPG）及细胞核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand, RANKL）mRNA表达水平。结果 与模型组比较，续苓健骨方中、高剂量组骨密度[（0.215±0.010）g/cm2、（0.222±0.013）g/cm2比（0.196±0.016）g/cm2]增高（P＜0.05或P＜0.01）；续苓健骨方高剂量组骨钙素[（87.0±8.9）ng/L比（100.5±16.8）ng/L]降低（P＜0.05），OPG mRNA [（0.97±0.23）比（0.78±0.17）]表达升高（P＜0.05）；续苓健骨方低、中、高剂量组RNAKL mRNA [（1.12±0.17）、（0.97±0.38）、（1.04±0.29）比（1.31±0.18）]表达降低（P＜0.05）。结论 续苓健骨方可提高骨质疏松模型大鼠的骨密度，可能与上调OPG mRNA、降低RANKL mRNA表达有关。