ExsA对维氏气单胞菌致病性的影响

维氏气单胞菌是一种重要的人鱼共患病原菌,可以引起多种水产生物的大量死亡,对水产养殖业以及公共卫生安全有重大危害。Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)是决定气单胞菌属致病性最关键的毒力机制之一,AraC家族转录因子ExsA作为主调控因子,响应环境条件变化,激活T3SS组装及效应蛋白分泌。为了探究ExsA对维氏气单胞菌致病性的影响,通过同源重组策略构建exsA基因敲除菌株,并检测其生物膜形成能力、黏附性及培养后上清的细胞毒性。结果显示,维氏气单胞菌中exsA基因缺失导致其生物膜形成能力、对宿主离体组织的黏附能力以及培养后上清液的细胞毒性显著下降。与野生型相比,exsA敲除株形成生物膜的能力降低1.5倍,对上皮细胞的黏附能力无显著性变化,但对小鼠离体肠道组织的黏附能力降低3.4倍,细菌培养后上清的细胞毒性下降1.2倍。研究结果表明ExsA对于维氏气单胞菌的毒力机制有重要调控作用,为进一步阐明T3SS对于病原菌的致病机制以及指导水生生物微生物感染防治策略奠定坚实基础。

加州鲈维氏气单胞菌拮抗菌的筛选

为筛选出对维氏气单胞菌(Aeromonas Veronii)有拮抗效果的最优菌株,本试验从湖北荆州太湖加州鲈池塘底泥中分离获得一株细菌C2-1,对其进行全基因组测序,并研究其生防作用机制。结果表明,细菌C2-1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),具有广谱抑菌性,对希瓦氏菌(Shiva's bacteria)、溶血链球菌(Streptococcus hemolysis)等多种水产病原菌的抑菌直径达18.57~25.28 mm。菌株C2-1具有较高的酸碱稳定性且对温度适应范围较为广泛。扫描电子显微镜镜观察发现细菌C2-1的发酵产物对维氏气单胞菌具有破坏效果。液质联用(LC-MS)分析该细菌包含多种不同的脂肽类活性物质,如伊枯草菌素等。研究发现,贝莱斯芽孢杆菌C2-1是防治维氏气单胞菌的潜力菌株,对维氏气单胞菌具有较好的抑制作用,且应用前景良好。

鲫鱼致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了分离并鉴定吉林省松原市查干湖地区引起鲫鱼多种脏器出血导致死亡的病原菌,试验从患病鲫鱼的鳃及脏器中进行病原菌的分离纯化,对分离的病原菌进行形态观察、生化特性鉴定、16S rDNA和管家基因gyrB PCR扩增及序列鉴定、动物回归试验(锦鲫鱼和斑马鱼)、半数致死量(LD50)的测定、毒力基因的检测、生物学特性的检测及药敏试验。结果表明:从患病鲫鱼脾脏中分离纯化得到一株优势菌株,命名为PC-1,根据生化特性初步判断该菌株为维氏气单胞菌。分离菌株PC-1的16S rDNA基因与管家基因gyrB经PCR扩增后,分别得到大小约为1470 bp和1022 bp的目的条带,目的条带测序后分别与GenBank中已公布的序列进行BLAST比对分析,发现与其他维氏气单胞菌的核苷酸相似性在99%以上。构建的进化树显示分离菌株PC-1与其他维氏气单胞菌菌株处于同一分支。健康锦鲫鱼感染PC-1后的临床症状与自然发病鲫鱼相似,经计算,锦鲫鱼的LD50为2.0×10^(5)cfu/mL,斑马鱼的LD50为3.2×10^(4)cfu/mL。该菌携带Ⅳ型菌毛(tapA)基因、气溶素(aer)基因、细胞毒性肠毒素(act)基因、细胞兴奋性肠毒素(alt)基因、极性鞭毛(fla)基因、核酶(exu)基因、丝氨酸蛋白酶(ser)基因、弹性蛋白酶(ahyB)基因、酯酶(lip)基因9种毒力基因,不携带热稳定肠毒素(ast)基因。分离菌株PC-1培养24 h后形成较为稳定的生物被膜且生物被膜形成能力最强,同时OD600值在1.8以上。分离菌株PC-1对红霉素、羧苄西林和氨苄西林3种抗生素耐药,对米诺环素、庆大霉素和头孢氨苄3种抗生素中度敏感,对多西环素、四环素、新霉素等13种抗生素敏感。说明吉林省松原市查干湖地区鲫鱼感染的病原菌为维氏气单胞菌,该菌对鲫鱼具有较强的致病性。

维氏气单胞菌生物膜体外模型的建立及影响因素的研究

为探索不同理化因素对致病性维氏气单胞菌（Aeramonasveronii,AV）‘TH0426成膜的影响,采用改良微孔板法建立致病性AV生物膜体外模型并对其进行了研究。结果表明,AVTH0426能够在聚乙烯酶标板表面形成生物膜,PH值4~6,10℃和NaCl浓度4 g/L培养18 h是形成生物膜的最适条件,黄颡鱼（Pseudobagrusfulvidraco）的肝脏提取液对AV TH0426形成生物膜有促进作用。这为进一步探讨维氏气单胞菌生物膜形成机制和致病机理提供了参考。

半刺厚唇鱼源维氏气单胞菌的分离鉴定

对典型症状为皮肤溃烂、体表出血、肝脏肿大的养殖半刺厚唇鱼(Acrossocheilus hemispinus)进行细菌的分离、鉴定和药物敏感性研究。从患病半刺厚唇鱼肝组织分离纯化细菌,并肌肉注射回归感染健康半刺厚唇鱼。PCR扩增获得分离菌株16S rDNA序列和gyrB基因全长序列,并开展分离菌株生理生化鉴定,毒力基因检测以及药物敏感性实验。分离菌株编号为AS0829L1,人工回归感染实验结果表明菌液浓度5×10^(10)、5×10^(9)、5×10^(8)CFU/mL可分别导致健康半刺厚唇鱼100%、100%和28.6%的死亡率,BLAST显示其16S rDNA序列和gyrB基因与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的相应序列高度同源,同源性分别高达99.93%和99.34%。综合分子生物学、生理生化特征、毒力基因检测结果证明分离菌株AS0829L1为维氏气单胞菌温和生物型(A.veronii bv.sobria)。药物敏感性实验显示,分离菌株对头孢曲松、头孢派酮、庆大霉素、新霉素、恩诺沙星、氧氟沙星等20种药物高度敏感,对羧苄西林、链霉素、氟苯尼考等5种药物中度敏感,对青霉素、诺氟沙星、红霉素等12种药物不敏感。本研究确定了发病半刺厚唇鱼的致病病原,开展了分离菌株的药物敏感性试验,为养殖生产中疾病的防控提供研究基础。

泥鳅溃疡病及病原温和气单胞菌生物学及分子特征研究

从江苏连云港东海县多家渔场大量死亡的养殖泥鳅深层溃烂组织、肝胰脏及腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对泥鳅具有非常强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等生物学性状检验;用PCR方法同时扩增其16S rRNA和gyrB基因,分析了16S rRNA和gyrB2种基因序列的同源性,并采用PAUP4.0的最大简约法(Maximum parsimony,MP)构建了基于2种基因的MP系统发生树。根据分离菌的致病性及表型与分子特征,确定本次引起泥鳅溃疡病的病原菌为气单胞菌属的温和气单胞菌;胞外酶及溶血活性检测表明分离菌均能产生蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶及DNA酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,用设计的特异性引物可扩增出病原菌溶血素基因片段;分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等9种药物耐药,对红霉素等4种药物中介,对菌必治等36种药物敏感。

乌鳢致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究

从患病乌鳢体内分离出一株细菌WL161,人工感染试验显示,该菌株具有较强的毒力。经理化特性及16SrRNA基因序列分析,该病原菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。药敏试验结果显示,头孢克肟、头孢曲松钠等药物对菌株WL161有较好的抑菌效果;部分毒力基因的检测结果证实,该菌携带气溶素、细胞毒性肠毒素、丝氨酸蛋白酶、黏附素、LuxS等多种毒力基因。

锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究

[目的]报道锦鲤的发病情况及其病原的主要生物学性状。[方法]对5尾发病及新鲜病死的锦鲤病变组织进行细菌检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性等表观分类学指征鉴定;同时择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定、健康锦鲤的人工感染试验和药敏试验。[结果]根据2株分离菌的形态特征及理化特性,结合16S rRNA序列测定与系统发育分析结果,判定其为气单胞菌属的维氏气单胞菌,其代表菌株HC050630A-1的16S rRNA基因序列长度为1457bp。人工感染试验表明,HC050630A-1株具有较强的致病作用。药敏试验结果显示,HC050630A-1菌株对供试37种抗菌药物中的头孢拉定等16种高度敏感,对头孢唑啉等13种敏感,对青霉素G等8种药物耐药。[结论]该研究为对该病的有效检验与防制等提供参考。

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株气溶素基因的生物信息学分析及原核表达

为深入研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)毒力因子气溶素(aerA),本实验从框镜鲤A.veroniiCY0806株中克隆aerA基因,进行同源性分析和构建系统进化树,并进行生物信息学分析、诱导表达和检测。结果表明aerA基因全长1 471 bp,编码490个氨基酸,CY0806株aerA与A.veronii EF620533.1株同源性为95%,与EF620533.1、AB109093.1和ET034117.1在同一分支;推测其相对分子质量约为54.33 ku,理论等电点为5.90,摩尔消光系数为138 810,半衰期为30 h(体外培养的哺乳动物网状细胞),不稳定性系数为31.87,脂肪系数为71.86,总平均疏水性为-0.445;aerA蛋白具有信号肽,不存在跨膜区,二级结构分析表明aerA蛋白结构比较复杂。本研究对aerA基因进行了原核表达,产物具有一定的免疫原性。研究结果为进一步研究A.veronii aerA的功能和诊断、防治奠定基础。

八味中草药对维氏气单胞菌TH0426生物膜形成的影响

为了解中药对维氏气单胞菌(Aerornomas veronii,AV)TH0426株生物膜形成的影响。采用微孔板半定量法,研究五倍子、红花、黄连、鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴及黄芩8味中药水煎液对AV TH0426株生物膜的影响。结果显示,低浓度五倍子、红花和黄连水煎液对菌株生长及生物膜形成均无明显影响;而高浓度五倍子和黄连水煎液可通过抑制菌株的生长来影响生物膜的形成,高浓度红花水煎液对生物膜抑制作用明显,且不影响菌株的正常生长;其余五味中药鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴和黄芩对菌株的生长及生物膜形成无明显影响。表明高浓度五倍子、红花及黄连水煎液能抑制AV TH0426株生物膜的形成,具有抗AV TH0426株生物膜的作用,这将为从抗生物膜角度防治维氏气单胞菌提供有益参考。

框镜鲤维氏气单胞菌的生物学特性

研究分别测定了维氏气单胞菌CY0806在液体LB中的生长曲线,培养温度、pH值、渗透压对其生长的影响,在不同培养基的生长状况,对小鼠和几种不同的养殖鱼类的致病力情况,以及毒力因子检测。结果显示:菌株CY0806在液体LB培养基中存在二次生长现象;其可以在营养琼脂、RS培养基、TSA培养基、麦康凯培养基、营养肉汤中生长良好;该菌株有较强的耐受性,可以在pH值3～11、培养温度20℃～40℃、氯化钠含量在0%～5%中生长;可以引发小鼠、鲢、团头鲂死亡,引起鲫、乌鳢发病;该菌株具有多种毒力基因:溶血素、气溶素、细胞毒性肠毒素、鞭毛、磷脂酶、丝氨酸蛋白酶、LuxS等。

不同动物源性维氏气单胞菌生物学特性比较研究

为深入了解维氏气单胞菌,本试验选取8株不同动物源性的维氏气单胞菌,并对其染色特性、理化特性、培养特性、耐药性、不同pH值、温度、渗透压对其生长的影响以及16S rRNA序列的相似性等生物学特性进行比较研究.结果显示,多数维氏气单胞菌在体外培养的老龄培养物中呈现多形性;理化特性大致相同;可以在TSA培养基、RS培养基、S.S.培养基、BS培养基、HE培养基上生长良好;可以在4 c｜C、25℃～40℃、pH值6～9、氯化钠含量0％～4％中生长;对青霉素G、克林霉素、万古霉素、多粘菌素B、氨苄西林、新生霉素等表现出耐药性;经比对,不同维氏气单胞菌菌株的16S rRNA基因序列具有较高的相似性,但存在一定的差异.研究结果将为维氏气单胞菌的检验检疫、疾病预防奠定基础,同时为该菌的深入研究提供数据支持.

维氏气单胞菌吉林分离株外膜蛋白AⅡ基因的克隆及生物信息学分析

目的克隆维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,AV)吉林株外膜蛋白AⅡ(OMPAⅡ)基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。方法根据维氏气单胞菌已知OMPAⅡ基因序列设计合成一对引物,通过PCR技术扩增OMPAⅡ基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定,通过BlastN分析维氏气单胞菌OMPAⅡ基因序列与其他菌种OMPAⅡ序列同源性,并构建系统进化树,同时对维氏气单胞菌OMPAⅡ蛋白进行生物信息学分析。结果克隆基因长1 001bp,与GenBank报道的基因序列同源性为95%,生物信息学软件分析OMPAⅡ蛋白无跨膜区,其N端含有1个信号肽,二级结构以β折叠和β转角为主,有10个区域可能存在B细胞抗原表位。结论成功的克隆维氏气单胞菌OMPAⅡ基因,并对OMPAⅡ蛋白的相关生物信息学进行了分析。

鲫鱼源维氏气单胞菌噬菌体的分离及生物学特性

本试验以鲫鱼源维氏气单胞菌为宿主菌,采用双层平板法从发病鲫鱼肠道中分离维氏气单胞菌的烈性噬菌体,并通过透射电子显微镜对噬菌体的形态进行了观察;同时还对噬菌体的生物学特性进行了测定,包括最适感染复数(MOI)、一步生长曲线、热稳定性、pH稳定性等。结果显示,本试验成功分离获得了1株鲫鱼源维氏气单胞菌噬菌体SJTJYCA01,该噬菌体的噬菌斑圆形透明,边缘清晰整齐,无晕环,其头部直径在45~60 nm,尾部长16~26 nm,属于短尾噬菌体科;噬菌体的最适MOI为0.1;感染宿主菌的潜伏期为20 min,裂解期为40 min,裂解量为57;在温度40℃以下和pH 5~10较为稳定。综上所述,SJTJYCA01为1株鲫鱼源维氏气单胞菌烈性噬菌体,该噬菌体能很好的适应水产养殖环境,在水生动物细菌性疾病防控中具有极大的应用价值。本试验丰富了水产致病菌噬菌体的菌种资源,并为进一步探索噬菌体防控技术提供了科学依据。

一株与EHECO_(157):H_7诊断血清交叉凝集的维罗纳气单胞菌温和生物变种的分离鉴定

目的对检出引起腹泻的新病原菌进行分离鉴定,为腹泻病原学理论及腹泻病因的防治提供依据。方法采取在SMAC上分离获纯培养菌、血清学检验、药敏试验和电子显微镜观察形态,以及微生物鉴定仪进行系统生化鉴定的方法。结果检出1株氧化酶阳性且能与EHECO157:H7诊断血清发生强凝集反应的维罗纳气单胞菌温和生物变种。结论该菌株的发现提示在分离EHECO157:H7时,为避免出现假阳性,必须进行系统化鉴定,以确保菌株鉴定的准确性。

产色素温和气单胞菌的特性及其外膜蛋白型研究

[目的]研究产色素温和气单胞菌的致病机理。[方法]从不同来源的病鳖和病鳗体内分离到4株产生棕色色素温和气单胞菌,并采用平板法进行检测。[结果]对鲫鱼胸基部注射9×108cfu/ml菌悬液0.4ml后,BA10、BA15和BA16株对鲫鱼的致死率在33.3%以上,M1株对鲫鱼无致死性。采用超声波破碎-SI法提取外膜蛋白(OMPs),SDS-PAGE电泳结果显示,4株温和气单胞菌的外膜蛋白相对分子质量范围在20.1～66.2kDa,其中1个鳗鱼分离株M1株属OMP1型,由8条主要蛋白带组成;其余3个鳖源分离株BA10、BA15和BA16株属OMP2型,由9条主要蛋白带组成。[结论]产色素与致病性无相关;4株产色素温和气单胞菌之间存在共同抗原;产色素温和气单胞菌的OMP型可能与菌株来源有关。

温和气单胞菌毒素的生物学活性研究

从腹泻病人粪便中分离到的４号温和气单胞菌（Ａｓ－４）产生溶血素（Ｈ）、肠毒素（Ｅ）和细胞毒素（Ｃ，简称ＨＥＣ毒素。粗制的ＨＥＣ毒素在家兔肠拌试验和乳鼠灌胃试验中使家兔和乳鼠小肠积液，引起Ｖｅｒｏ细胞和中国仓鼠（ＣＨＯ）细胞的细胞毒反应，可使不同动物种类的红细胞溶血，尾静脉和腹腔注射导致小白鼠死亡。上述生物学活性均可被抗－ＨＥＣ毒素血清中和而失效。纯化毒素经５６℃１０ｍｉｎ处理，其肠毒性、细胞毒性及溶血毒性也将失去。

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株鞭毛flaA基因的克隆与生物信息学分析

以框镜鲤Cyprinus carpio维氏气单胞菌Aeromonas veronii CY0806株细菌基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得flaA基因,将其克隆并测序,测序结果与气单胞菌属的不同菌株进行相似性分析,并对flaA基因编码蛋白质进行生物信息学分析.结果显示:获得框镜鲤维氏气单胞菌鞭毛flaA基因,长915 bp,编码304个氨基酸,系统进化树分析,其与其他维氏气单胞菌flaA基因处于同一分支,相关生物信息学分析显示,flaA基因编码的蛋白质相对分子质量32 098.66,等电点5.57,半衰期30 h,不稳定系数为32.31,脂肪系数81.05,不存在信号肽和跨膜区,二级结构预测:flaA基因以α螺旋和β折叠为主,同时,以同源建模法预测了flaA基因编码蛋白的三维立体结构.

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株OMPAⅠ基因的克隆及生物信息学分析

为鉴定维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,AV)吉林分离株合适的诊断或免疫用抗原,研究依据GenBank维氏气单胞菌外膜蛋白AⅠ基因(OMPAⅠ)设计引物,通过PCR成功扩增出长度为1 026 bp的基因片段,通过序列分析表明:该基因与维氏气单胞菌AB2902300 OMPAⅠ的同源性为93%,与其他气单胞菌同源性大于80%;同时通过生物信息学软件对其蛋白的分子特征进行了预测,为OMPAⅠ可能做为诊断或免疫用抗原提供了理论依据。

锦鲤维氏气单胞菌JLL-1株的部分生物学特性研究

为了研究JLL-1菌株的部分生物学特性,试验采用平板计数法测定其生长曲线,划线培养法观察该菌在不同培养基中的培养特性,生化反应管及相关培养基检测其理化特性,纸片扩散法测定其耐药性以及通过控制不同的培养条件检测不同培养温度、pH值及渗透压对其生长的影响。结果表明：菌株JLL-1在LB培养基中存在二次生长现象;可在麦康凯培养基、BS培养基、RS培养基、SS培养基、TSA培养基、HE培养基及营养肉汤中生长良好;该菌对青霉素、多黏菌素B、氨苄西林及克林霉素完全耐药,占测定药物的16.67%,但敏感药物可达到66.67%;该菌耐受性较强,可在25~42℃、pH值为6~10、NaCl含量为0~4%的环境中生长。说明该菌可在不同培养基上生长,并且有较强的环境适应性,可根据药物敏感试验结果指导临床用药。