IFN-α和IFN-γ逆转MR2细胞维甲酸耐药的实验研究

目的:探讨IFN-α和IFN-γ与全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)联合逆转MR2细胞对ATRA耐药的可能性及其机制。方法:IFN-α、IFN-γ及ATRA单独或两种IFN分别与ATRA联合作用于对ATRA耐药的细胞株MR2后,采用MTT比色法检测细胞的增殖,用光镜观察、NBT还原实验及流式细胞仪检测细胞的分化,用间接免疫荧光法检测早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)蛋白的表达。结果:两种IFN均能抑制MR2细胞的增殖;IFN与ATRA联合应用时抑制作用更加显著;但两种IFN无论是单独应用还是与ATRA联合应用,二者之间均无统计学意义(P>0.05)。两种IFN也能诱导MR2细胞发生一定程度的分化;二者分别与ATRA联合应用时作用更加显著,但IFN-γ+ATRA组诱导MR2细胞分化的作用明显强于IFN-α+ATRA组(P<0.05)。两种IFN都能诱导PML蛋白的表达。结论:IFN-γ与ATRA联合应用逆转MR2细胞对ATRA耐药的作用强于IFN-α与ATRA的联合,可能与IFN-α和IFN-γ信号传导途径的不同有关。

姜黄素诱导维甲酸耐药的NB4-R1细胞凋亡及其机制

为了探讨姜黄素对维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞生长抑制作用及其机制,以耐药的NB4-R1细胞为实验对象,用MTT法检测细胞生长情况,用光学显微镜观察细胞形态特征,用流式细胞术测定细胞线粒体电位变化,用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果表明,虽然NB4-R1细胞对维甲酸耐药,但对姜黄素的敏感性与对维甲酸敏感的NB4细胞一致,姜黄素至少对NB4-R1细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性。细胞形态学检查显示,经20μg/L姜黄素处理后的细胞内出现凋亡小体。流式细胞术检测发现,NB4-R1细胞经姜黄素处理后线粒体膜电位下降。Western blot检测显示,caspase3前体表达下降,活化caspase3表达升高,BCL-XL表达降低,剪切形式的PARP表达水平明显上调。结论:姜黄素能抑制NB4-R1细胞生长并诱导其凋亡。

维甲酸耐药细胞与敏感细胞的差异表达蛋白分析

背景与目的:维甲酸耐药机制有待进一步的深入研究。蛋白质组学以所有蛋白质为研究对象,从细胞水平及整体水平研究蛋白质的组成及其变化规律。本实验应用蛋白组学技术整体比较维甲酸耐药细胞与敏感细胞蛋白表达谱,筛选差异表达蛋白,以期获得维甲酸耐药相关蛋白。方法:提取维甲酸耐药细胞株MR2及维甲酸敏感细胞株NB4的总蛋白,通过双向凝胶电泳分离,获得二者高质量的蛋白表达谱,经PDQuestv7.1软件比较分析,筛选出二者间差异表达的蛋白质点,通过质谱仪鉴定表达差异的蛋白。结果:获得了分辨率高、重复性好的APL细胞的双向电泳图谱。PDQuestv7.1软件分析结果表明,MR2细胞及NB4细胞的pH4～7双向凝胶电泳所展示的蛋白点分别有(890±45)个和(912±56)个。二者间有57个差异显著的蛋白点,其中23个在MR2细胞中上调,34个下调。经质谱鉴定了10个蛋白,鉴定成功率达70%,鉴定的蛋白涉及癌蛋白、细胞周期调控和信号转导相关蛋白质。结论:应用双向凝胶电泳技术整体展示了维甲酸耐药细胞株MR2及敏感细胞株NB4的蛋白表达谱,并分析、鉴定、筛选出与维甲酸耐药相关的差异表达蛋白,为进一步从多因素角度研究认识维甲酸耐药机制提供了新的线索。

构建雄黄诱导维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病NB4-R1细胞凋亡的蛋白质双向电泳图谱

目的构建雄黄(四硫化四砷,tetra-arsenic tetra-sulfide,As4S4)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)维甲酸耐药细胞株NB4-R1细胞凋亡前后的差异蛋白质组表达谱。方法 首先应用MTT法、透射电镜、AnnexinV/PI双染法和激光共聚焦显微镜的一系列体外实验定性化和定量化雄黄诱导NB4-R1细胞凋亡的作用;然后应用高分辨二维双向电泳技术构建雄黄诱导维甲酸耐药细胞株NB4-R1凋亡前后的差异蛋白质组表达谱。结果 雄黄对NB4-R1细胞的生长抑制效应呈剂量和时间依赖性,雄黄作用24h半数抑制浓度(IC50)为(24.06±0.19)μmol/L,48h IC50为(9.50±0.13)μmol/L,72h IC50为(6.55±0.03)μmol/L;确定了25μmol/L雄黄作用24h和48h时分别为NB4-R1细胞凋亡主群的早期和凋亡晚期阶段;成功构建了雄黄诱导维甲酸耐药细胞株NB4-R1凋亡前后的差异蛋白质组表达谱,ImageMasterTM2D Platinum图像分析软件分析显示,未处理组(R0)、处理24h组(R24)和处理48h组(R48)的蛋白质组表达图谱分别平均含1069、975和893个点;R24与R0的匹配率为79.94%,R48与R0的匹配率为69.33%,R24与R48的匹配率为71.91%。结论 成功构建雄黄诱导维甲酸耐药细胞株NB4-R1凋亡前后的差异蛋白质组表达谱,为今后从整体上更好地理解雄黄诱导耐药APL细胞凋亡的蛋白质组传导网络以及筛选恶性血液肿瘤新型生物标志物和药物靶标方面奠定了基础。

应用蛋白质组技术对维甲酸耐药相关蛋白的初步分析

目的探讨采用蛋白质组学技术研究维甲酸的耐药机制。方法提取维甲酸敏感细胞株NB4及维甲酸耐药细胞株MR2的总蛋白,进行双向凝胶电泳识别差异表达蛋白,经质谱分析、数据库搜索进行蛋白鉴定。结果单张凝胶电泳图上呈现约600多个蛋白点,组间的匹配性较好,初步筛选出三个表达差异蛋白,经鉴定分别为DJ-1蛋白、热休克蛋白70及KIAA1289未知功能蛋白。结论应用双向电泳连接质谱的蛋白质组学方法有助于筛选到耐药相关的表达蛋白,为进一步研究维甲酸耐药机制提供分子基础。

TopoⅡβ在苦参碱诱导维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的作用研究

[目的]探讨TopoⅡβ在苦参碱诱导维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病(acute promye locyticleukemia,APL)细胞分化的作用。[方法]以全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)敏感的APL细胞系NB4及其ATRA耐药细胞株NB4-R1作为研究对象,选取对数生长期细胞,分为空白细胞对照组、ATRA组、苦参碱组、ATRA+苦参碱组。培养3d后,研究各组细胞形态的变化;用NBT还原实验分析细胞分化能力的变化;流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达变化;免疫组化法检测拓扑异构酶TopoⅡβ亚型的表达变化。[结果]与ATRA组相比,0.1mmo.lL-1苦参碱可协同1μmo.lL-1维甲酸诱导NB4-R1细胞分化,使NBT还原阳性率明显增高(12%VS 41.33%),并能诱导NB4-R1细胞表面分化抗原CD11b的表达百分率升高(32.776±6.610 VS 46.888±7.847)%;而对NB4细胞则无明显变化。单用苦参碱对NB4及NB4-R1细胞内TopoⅡβ均无明显作用;维甲酸联合苦参碱能降低耐药细胞株NB4-R1细胞内TopoⅡβ含量(P<0.05)。[结论]苦参碱体外能协同ATRA使NB4-R1细胞分化成熟,其作用机制可能与调控TopoⅡβ的表达有关。

三氧化二砷对维甲酸耐药的神经母细胞瘤细胞SK-N-AS中HoxC9表达的影响

目的本研究通过检测三氧化二砷(ATO)处理前后维甲酸(RA)耐药的SK-N-AS细胞中HoxC9以及EZH2的表达,初步探寻ATO促进RA耐药的NB细胞分化的具体机制。方法用CCK-8试剂盒测定ATO对NB细胞SK-N-AS增殖抑制率,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,并测量神经突触总长度值。利用质谱技术和非标定量蛋白组学方法检测ATO处理后SK-N-AS细胞蛋白信号丰度变化,并对与NB细胞分化相关蛋白进行差异化分析。Western Blot检测HoxC9、HoxD8及EZH2蛋白的表达情况。结果(1)ATO对SK-N-AS细胞的杀伤作用在4~128μM范围内呈浓度依赖性,ATO对SK-N-AS细胞的半抑制浓度IC50=95.36μM。(2)16μM的ATO处理SK-N-AS细胞24h后,神经突触总长度值升高,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)16μM ATO处理24h后,SK-N-AS细胞内共鉴定到6424个表达蛋白,其中与分化相关的蛋白,上调的包括正常神经元分化标记物MAPT、NEFM等;下调的包括神经母细胞成瘤性标记物PHOX2B。(4)Western Blot结果表明,16μM ATO处理SK-N-AS细胞24h后,HoxC9、HoxD8蛋白的表达水平上调,EZH2蛋白表达水平下调。结论(1)ATO可诱导SK-N-AS细胞的神经突触增多,上调SK-N-AS细胞中神经元正常分化相关的标记物HoxC9及HoxD8的表达,下调神经母细胞成瘤性标记物PHOX2B及EZH2。(2)ATO可能通过下调EZH2重新激活HoxC9的表达。

姜黄素联合全反式维甲酸诱导耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞分化的实验研究

本研究旨在探讨姜黄素联合全反式维甲酸(ATRA)对耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞分化的影响及其分子机制。以耐药的NB4-R1细胞为实验对象,对细胞进行计数和细胞形态学观察,应用流式细胞术(FCM)检测姜黄素单用或联合ATRA对NB4-R1细胞增殖、分化的影响;用Western blot检测AKT磷酸化在细胞分化中的变化。结果显示,全反式维甲酸对NB4-R1细胞增殖无影响,但可增强姜黄素对NB4-R1生长的抑制作用。单用姜黄素或全反式维甲酸对细胞分化无影响,姜黄素联合全反式维甲酸可明显诱导细胞CD11b表达,细胞在形态上呈明显分化特征。全反式维甲酸可在短时间内促进NB4细胞AKT第473苏氨酸磷酸化,而对NB4-R1细胞中的AKT磷酸化影响不大。姜黄素可以促进NB4-R1细胞AKT磷酸化,而联合全反式维甲酸可进一步增强AKT磷酸化。结论:PI3K/AKT通路失活可能是导致APL细胞耐药的因素之一,而姜黄素通过活化PI3K/AKT信号通路逆转APL耐药,促进NB4-R1细胞分化。

PLSCR1在苦参碱逆转APL细胞维甲酸耐药中的意义

目的观察磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase 1,PLSCR1)在苦参碱(matrine,MAT)诱导维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)耐药急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞分化的表达,并探讨其与环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)途径的相关性。方法以ATRA敏感的APL细胞系NB4以及ATRA耐药株NB4-R1为研究对象。通过NBT还原实验以及流式细胞仪(CD11 b)检测0.1 mmol/L MAT联合1μmol/L ATRA对两细胞株分化标记的影响;采用Western blot、实时荧光定量PCR技术测定细胞PML/RARα、PLSCR1蛋白及基因表达;同时应用PKA拮抗剂H89联合作用,观察细胞分化抗原及上述蛋白/基因表达的变化。结果 MAT联用ATRA能明显提高NB4-R1细胞NBT及CD1 1 b阳性率,并显著下调PML/RARα融合蛋白/基因的表达(P<0.05,P<0.01)。单用ATRA能使NB4细胞PLSCR1在蛋白及mRNA水平表达均得到明显增强(P<0.01),而在NB4-R1细胞内同样表达上调,但仅蛋白水平差异有统计学意义(P<0.01)。在联用MAT后,两细胞株PLSCR1蛋白表达进一步上升(P<0.01),并且NB4-R1细胞mRNA表达水平差异有有统计学意义(P<0.05)。上述作用均能被10μmol/L H89逆转(P<0.05,P<0.01)。结论 MAT联合ATRA能显著诱导NB4-R1细胞获得再分化,同时抑制PML/RARα融合基因/蛋白的表达,这可能与其上调PLSCR1表达有关。

尿多酸肽联合环腺苷酸诱导维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡的实验研究

目的探讨尿多酸肽（CDA-Ⅱ）单独和联合环腺苷酸（cAMP）对维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞的作用。方法以维甲酸耐药的APL细胞株NIM—R2为体外模型，观察使用CDA—Ⅱ单独和联合cAMP处理前后细胞生长和形态的改变；同时利用流式细胞术检测细胞的凋亡特征，包括细胞内DNA含量的分布、亚二倍体（sub—G1）细胞群所占比例、凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平等；并通过电泳鉴定因基因组DNA非随机性降解导致的梯状DNA。结果CDA-Ⅱ可以通过降低细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，诱导NB4-R2细胞发生凋亡；cAMP则能显著加强CDA—Ⅱ的这一促凋亡作用1g／LCDA-Ⅱ联合100μmol／LcAMP共同处理NB4-R2细胞48h和72h时Bcl-2阳性细胞比例分别下降至（15．1±4．8）％和（7．3±2．9）％。100μmol／L cAMP单独作用可使MB4-R2细胞的Bcl-2阳性率由（92．0±0．6）％下降至（75．3±2．0）％。结论尿多酸肽CDA—Ⅱ联合cAMP对于维甲酸耐药的APL细胞株具有强烈的诱导凋亡效应。

鼠尾草酸和促进白血病细胞分化凋亡及逆转维甲酸耐药的研究

目的通过观察鼠尾草酸对 HL-60细胞增殖,诱导分化和凋亡的影响,与全反式维甲酸和三氧化二砷联合应用时的协同作用,以及鼠尾草酸对维甲酸耐药细胞逆转耐药的效果,探讨其发挥作用的分子途径。

维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病

维甲酸即维生素甲酸,由环乙烯、侧链和极性基团三部分组成。维甲酸异构体分为三种,全反式维甲酸(ATRA)、9顺式维甲酸(9C-RA)和13顺式维甲酸(13C-RA)。一般所说的维甲酸是指A-TRA,它是一种活性较强的诱导体。目前,治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)使用的是ATRA。 APL是急性粒系白血病中的一种死亡率极高的疾病。以前,采用化学疗法治疗,白血病细胞被破坏后易并发DIC,形成恶性循环。治疗极为困难。

尿多酸肽诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株凋亡的实验研究

目的探讨尿多酸肽(CDA-Ⅱ)对急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞NB4及耐维甲酸的NB4-R1细胞的凋亡作用。方法以NB4和NB4-R1细胞作为体外模型,观察CDA-Ⅱ作用前后细胞的形态和生长增殖情况。流式细胞术检测细胞凋亡特征。Western印迹法检测凋亡调控蛋白蛋白激酶C(PKCδ)及Caspase-3的水解活化。结果 CDA-Ⅱ作用于NB4和NB4-R1细胞后,细胞生长受到抑制;形态上观察到分化和凋亡现象;Annexin V-PI法发现,用药24 h后NB4和NB4-R1细胞凋亡比例分别上升至(58.7±3.1)%和(87.8±0.5)%;PKCδ和Caspase-3水解活化。结论 CDA-Ⅱ作用于细胞后,水解活化Caspase-3,裂解PKCδ生成活性片段,诱导细胞凋亡。

环磷腺苷和其衍生物8-CPT-cAMP诱导分化效应的比较实验

目的:比较环磷腺苷和其衍生物8-CPT-cAMP在联合全反式维甲酸(ATRA)诱导耐药型早幼粒白血病细胞株NB4-R1分化中的作用。方法:将环磷腺苷和8-CPT-cAMP分别与ATRA联合处理NB4-R1细胞株,在不同时间点收集细胞,观察细胞形态、硝基四氮唑蓝(NBT)的还原能力,以及细胞表面分化抗原CD11b的表达情况。结果:单独使用环磷腺苷或8-CPT-cAMP均无法诱导NB4-R1细胞分化;但8-CPT-cAMP可以恢复NB4-R1细胞对ATRA的反应性,8-CPT-cAMP与ATRA合用可以使NB4-R1细胞表面分化抗原CD11b的阳性率达到(86.5±7.78)%,与对照组和ATRA单用组相比均有显著性差异;同时,细胞对NBT的还原能力也明显升高,比对照组或ATRA单用组提高了5倍左右。而环磷腺苷与ATRA联合处理只能诱导NB4-R1细胞出现部分分化的特征,CD11b的阳性率可上升至(50.7±3.11)%,但细胞对NBT的还原能力却没有明显提高。结论:环磷腺苷对维甲酸耐药型细胞株NB4-R1细胞的分化具有一定的促进作用,但是效果明显不如其衍生物8-CPT-cAMP。

呈现急性早幼粒细胞白血病表现的特殊亚型白血病

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一种特殊亚型,占其10%~15%[1],含嗜天青颗粒的早幼粒细胞在骨髓和外周血中异常增殖是其独特的形态学特征。APL具有严重的出血倾向,并可快速进展至弥散性血管内凝血,曾被认为是AML中恶性程度最高的类型[2]。t(15;17)染色体易位形成PML-RARA融合基因,被发现是维甲酸(ATRA)诱导分化治疗的靶点,同时采用ATRA和蒽环类化疗药物的标准诱导治疗方案可实现90%~95%的完全缓解率(CR)[3],但许多患者出现了延迟复发。砷剂(ATO)联合ATRA的一线应用从根本上改变了这类疾病的预后,即使不进行化疗也完全可能治愈,APL已成为AML中预后最好的亚型。