宽体金线蛭提取物对HEK293细胞维甲酸诱导基因蛋白样受体(RLRs)通路的影响

维甲酸诱导基因蛋白样受体(RLRs)信号通路是机体重要的抗病毒作用途径。宽体金线蛭体内含有抗凝血的活性物质,主要用于治疗血栓等疾病,但对于该信号通路的影响尚无任何报道。本试验目的是采用聚肌苷酸聚胞苷酸(Poly I∶C)建立HEK293细胞RLRs信号通路激活模型,在此基础上揭示宽体金线蛭提取物(LE)对HEK293细胞RLRs信号通路的影响。试验首先转染3个不同质量浓度(1、2、4μg·mL^(-1))的Poly I∶C至HEK293细胞,并分别处理12 h、24 h和48 h,以维甲酸诱导基因I(RIG-I)的蛋白表达水平和mRNA转录水平为RLRs通路激活的指标。RLRs信号通路激活之后,采用LE对HEK293细胞进行处理,共设置4组,每组3个重复,分别为:对照组、2μg·mL^(-1) Poly I∶C转染组、2μg·mL^(-1) Poly I∶C转染且添加150μg·mL^(-1)的水蛭提取物、2μg·mL^(-1) Poly I∶C转染且添加300μg·mL^(-1)的水蛭提取物。处理时长分别为24 h和48 h。试验结果表明,转染3个剂量的Poly I∶C在3个处理时长均引起细胞活力降低,2μg·mL^(-1)和4μg·mL^(-1) Poly I∶C转染HEK293细胞12 h、24 h和48 h均显著提高了RIG-I蛋白的表达量,4μg·mL^(-1)的Poly I∶C转染组RIG-I mRNA转录水平在24 h和48 h显著提高。选择Poly I∶C质量浓度2μg·mL^(-1),处理24 h和48 h作为后续试验激活RLRs的处理条件。质量浓度为150μg·mL^(-1) LE可以显著抑制Poly I∶C介导的细胞活力降低;300μg·mL^(-1)的LE显著降低了RIG-I的蛋白水平;150μg·mL^(-1)和300μg·mL^(-1) LE处理24 h和48 h后均显著抑制了β干扰素的mRNA转录和生成。据此得出如下结论:Poly I∶C转染HEK293细胞成功地激活了RLRs信号通路,宽体金线蛭提取物具有促进HEK293细胞活力和抑制β干扰素生成的作用。

E3泛素酶对维甲酸诱导基因蛋白Ⅰ分子活性的调控

维甲酸诱导基因蛋白Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)是细胞内重要的固有免疫受体,能够识别病毒双链RNA,启动抗病毒免疫应答,从而在病毒感染早期发挥作用。RIG-Ⅰ活性受泛素系统,包括各种泛素酶、泛素链及其他因子的严格调控。近年来,不断有研究报道新的E3泛素酶成员参与抗病毒调控,其作用机制和效应各不相同。围绕不同E3泛素酶如何对RIG-Ⅰ进行精确调控以及泛素链活化RIG-Ⅰ的机制进行深入研究,推进了对RIG-Ⅰ泛素化调控的认识,本文对此综述。

鸭维甲酸诱导蛋白Ⅰ基因原核表达和单克隆抗体的制备及鉴定

本试验旨在制备针对鸭维甲酸诱导蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)全长蛋白的单克隆抗体。从鸭脾脏cDNA中扩增鸭RIG-Ⅰ基因N端长度均为900bp的a(1—900bp)和b(751—1650bp)2段基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-30a中;重组质粒转化BL21感受态细胞后,经IPTG诱导表达,将获得的目的蛋白免疫BALB/c小鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,并进行间接ELISA检测。结果显示,筛选出17株与分段表达的鸭RIG-Ⅰ蛋白有良好反应性的杂交瘤细胞株,测定单克隆抗体上清效价均为1∶512;间接免疫荧光(IFA)与Western blotting分析结果显示,10H7C3和2A10A2 2株单克隆抗体与原核表达的鸭RIG-Ⅰ全长蛋白有良好的反应性。本研究制备了特异性鼠抗鸭RIG-Ⅰ单克隆抗体,为进一步研究RIG-Ⅰ基因的功能奠定了基础。

维甲酸诱导蛋白Ⅰ在禽类抗病毒天然免疫中的研究进展

维甲酸诱导蛋白Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)是机体先天性免疫系统中的一类重要受体,能识别细胞中的外源RNA,诱导Ⅰ型干扰素、细胞因子及趋化因子的产生,对机体抗病毒天然免疫的建立有重要作用。研究结果发现,RIG-Ⅰ在哺乳动物中能抑制流感病毒和新城疫病毒等病毒。鸡体内不含有RIG-Ⅰ,鸭RIG-Ⅰ能在鸡源细胞系中产生显著的抗禽流感病毒效果。作者重点论述了RIG-Ⅰ的作用机制,展望了RIG-Ⅰ在提高禽类抗病力和推进禽类先天性免疫基础研究方面的潜力。

敲低维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)抑制全反式维甲酸诱导的NB4急性早幼粒白血病细胞的分化

目的探讨慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)敲低NB4急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)对全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化的影响及其机制。方法将含有人RIG-Ⅰ基因shRNA序列(RIG-Ⅰ-shRNA)及含绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒感染NB4细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)及Western blot法分别检测ATRA诱导前后NB4细胞RIG-Ⅰ mRNA和蛋白水平;流式细胞术观察慢病毒感染效率和RIG-Ⅰ-shRNA对ATRA诱导NB4细胞分化的影响;Western blot法检测敲低RIG-Ⅰ水平后,ATRA处理对蛋白激酶B308位苏氨酸(AKT-Thr308)磷酸化的调控效应。结果含RIG-Ⅰ-shRNA序列的慢病毒可成功感染NB4细胞,下调ATRA诱导的RIG-Ⅰ水平;敲低RIG-Ⅰ后,明显抑制ATRA诱导NB4细胞分化,同时上调AKT-Thr308磷酸化水平。结论敲低NB4细胞RIG-Ⅰ蛋白可上调AKT-Thr308磷酸化水平抑制ATRA诱导的急性早幼粒白血病细胞分化。

维甲酸诱导基因Ⅰ研究进展

维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ),能在多种细胞中被不同的刺激诱导表达,是RNA病毒致天然免疫的重要调控因子.概述其发现、诱导、结构、功能、机理及同源蛋白等的研究现状,并展望相关动向.

编码糖蛋白B的裸基因疫苗诱导单纯疱疹病毒Ⅰ型感染小鼠的体液和细胞免疫

[目的]用编码单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)糖蛋白B的pDNA转染小鼠,研究基因疫苗治疗感染性疾病的有效性,并分析免疫反应.[方法]采用血管内注射方法,将含有不同剂量、不同pDNAs的生理盐水注入Balb/c小鼠体内,1周后行再次免疫,观察以不同组合pDNA进行免疫的实验组和对照组小鼠被致死剂量HSV-1感染后生存率间的差异.通过潜伏感染的检测、血清中细胞因子水平的测定、细胞毒性反应的测定及中和实验评价免疫效果.[结果]接种pG.gB或接种pGEG.gB的小鼠,与相应对照组比较,生存率和诱导产生中和抗体的效价与剂量呈正相关,pGEG.gB免疫组对P815.gB细胞有显著的细胞毒性作用,pGEG.gB免疫小鼠的脾细胞增殖反应显著强于pG.gB免疫的小鼠;pG.gB和pGEG.gB免疫后的小鼠血清中IL-12和IFN-γ水平均显著升高.[结论]裸pDNA的经小鼠尾静脉免疫可诱导HSV-1感染小鼠的体液和细胞免疫应答,对小鼠HSV-1急性感染有明显的预防和治疗作用,且含有EBNA1和oriP的EBV质粒载体明显增强CTL活性和增殖反应.

视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ在抗禽源病毒先天免疫中的作用研究进展

文章介绍了视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)的结构、对病毒的识别机制、抗禽流感病毒与新城疫病毒的先天免疫作用,为其抗病毒机制的深入研究提供参考。

维甲酸诱导分化治疗口腔癌的研究进展

诱导分化治疗是肿瘤化学治疗的一个新领域,它是应用化学药物诱导肿瘤细胞分化并逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型,使其成为正常或接近正常的细胞,从而达到治疗肿瘤的目的。常见的诱导分化剂有β—萝卜素、维甲类化合物等,到目前为止,维甲类化合物是被研究和临床应用最广泛的诱导分化剂,维甲类化合物是VitA的衍生物,其合成种类已超过1500种,其中以全反式维甲酸(All—trans retinoic acid,ATRA)和顺式维甲酸(Cis—retinoicacid,cRA)最为常用。维甲酸口服后直接吸收,通过肝脏后与特异性维甲酸结合蛋白结合,被转运到全身靶器官,从而发挥诱导分化的作用。维甲酸具有重要的生理功能,它对某些组织细胞生长发育及功能维持起重要作用,,70年代开始应用于疾病的治疗。近年来。

泛素化修饰对维甲酸诱导基因I样受体家族(RLRs)信号通路分子调控作用的研究进展

维甲酸诱导基因I样受体家族(retinoid acid-inducible gene-I-like receptors,RLRs)信号通路作为众多抗感染免疫信号通路之一,在诱导促炎细胞因子、趋化因子和I型干扰素产生等方面发挥重要的调控作用。作为蛋白质翻译后修饰之一的泛素化(ubiquitination),是由泛素蛋白(ubiquitin)与目标蛋白上不同的氨基酸位点产生结合来调控蛋白的命运,如启动蛋白酶体途径降解蛋白或激活转运等功能。而RLRs信号通路分子的泛素化修饰既是调控多种效应因子的方式之一,也是病毒经此诱发动物重要疾病以及自身免疫病、慢性炎症的经典路径之一。本文主要综述RLRs信号通路中重要的效应器分子的典型结构特征、泛素化修饰类型和功能,探讨泛素化修饰调控RLRs信号通路关键分子的作用,为相关疾病的干预或治疗提供参考。

热休克蛋白27对水泡性口炎病毒体外增殖的调控作用

本研究旨在探究热休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)体外增殖及VSV感染介导的维甲酸诱导基因I样受体家族(retinoid acid-inducible gene-I-like receptor, RLR)信号通路的作用及机制。利用实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、病毒滴度测定及免疫荧光等方法,首先检测VSV感染对HSP27 mRNA和蛋白表达的影响,进而验证过表达和干扰HSP27对VSV增殖的影响,进一步探究HSP27对VSV感染介导的RLR信号通路的影响,最后分析HSP27与RLR信号通路靶分子的相互作用及共定位情况。结果表明,VSV感染可促使HSP27基因转录和蛋白表达上调,稳定过表达和瞬时过表达HSP27均能显著抑制VSV的体外增殖;干扰宿主细胞中HSP27表达可促进VSV增殖。HSP27能够增强VSV及维甲酸诱导基因I蛋白(retinoic acid-inducible gene I protein, RIG-I)介导的IFN-β的产生及RIG-I的蛋白表达,而且HSP27与RIG-I相互作用并共定位于细胞质中。本研究揭示了HSP27靶向RIG-I上调其表达,增强RLR信号通路的转导,进而负调控VSV体外增殖,为深入揭示宿主因子HSP27在病毒感染中的作用机制奠定基础。

乌鬃鹅RIG-Ⅰ基因的克隆及初步分析

维甲酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)是一类胞质内模式识别受体,在机体抗病毒天然免疫过程中发挥重要作用。本研究通过poly(I∶C)和5′ppp-dsRNA刺激原代鹅胚成纤维细胞,采用RT-PCR扩增获得了乌鬃鹅RIG-ⅠCDS,其全长2805bp,编码934个氨基酸。氨基酸序列分析表明,该蛋白无跨膜区,无信号肽,位于细胞质和细胞核,故推测gRIG-Ⅰ蛋白为胞质内可溶性蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,poly(I∶C)和5′ppp-dsRNA能显著上调gRIG-ⅠmRNA水平。研究结果为RIG-Ⅰ在鹅抗病毒天然免疫研究奠定了一定的理论基础。

维甲酸诱导分化视网膜母细胞瘤的研究进展

维甲酸是诱导分化剂中重要药物,通过增强抑癌基因表达,影响蛋白激酶,调节信号通路,与维甲酸受体结合,受体再与特异性 DNA 序列结合,进而调节其邻近靶基因的表达,以及通过 JNK(c-jun 氨基末端激酶)的磷酸化,诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡,促进其分化成正常成熟的细胞。现就维甲酸诱导分化视网膜母细胞瘤的机制研究作一综述。

手足口病患儿遗传学及生理学实验室蛋白2、维甲酸诱导基因I和黑色素瘤分化相关基因5表达及临床意义

目的检测遗传学及生理学实验室蛋白2(LGP2)、维甲酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)在手足口病(HFMD)患儿的表达水平,探索其在HFMD中可能的临床意义。方法选择2020年5月至2021年5月西安交通大学第二附属医院、西安市儿童医院和西安市中心医院就诊的50例HFMD患儿作为研究对象,并以同期同年龄段体检儿童20例作为对照组。HFMD患儿按病原学检测结果分为肠道病毒71(EV-A71)型和柯萨奇病毒A6(CV-A6)型,再根据疾病轻重程度分为轻症、重症患儿。比较并分析各组LGP2、RIG-I和MDA5的mRNA相对表达量及三者相关性。结果50例HFMD患儿中EV-A71型26例(轻症16例,重症10例),CV-A6型24例(轻症17例,重症7例)。HFMD组患儿与对照组儿童的年龄、性别差异均无统计学意义(P>0.05)。LGP2 mRNA在EV-A71型和CV-A6型HFMD患儿中的相对表达量分别为2.37(1.78,3.25)%和1.88(1.35,3.13)%,均低于对照组2.97(2.61,3.55)%,CV-A6型HFMD患儿与对照组间差异有统计学意义(Z=-2.310,P=0.021);RIG-I mRNA在EV-A71型和CV-A6型HFMD患儿中的相对表达量分别为9.95(7.79,14.62)%和9.78(7.04,15.83)%,均低于对照组18.47(13.00,21.07)%,差异均有统计学意义(均P<0.05);MDA5 mRNA在EV-A71型和CV-A6型HFMD患儿中的相对表达量分别为4.41(2.82,5.99)%和3.98(2.18,7.41)%,均低于对照组5.10(3.52,7.71)%,但差异均无统计学意义。LGP2、RIG-I和MDA5 mRNA在EV-A71型和CV-A6型HFMD患儿轻症、重症间表达水平差异均无统计学意义。LGP2、RIG-I和MDA5 mRNA表达量具有较高相关性(均P<0.001)。结论LGP2、RIG-I和MDA5 mRNA相对表达量在HFMD患儿中呈不同程度降低,且三者具有相关性。

小鼠Rig-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表达载体pGEX-4T2中,构建pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N,再将Rig-Ⅰ基因剩余部分克隆到已构建有Rig-Ⅰ-N部分片段的pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N中,构建融合表达载体pGEX-4T2-Rig-Ⅰ,将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物GST-Rig-Ⅰ融合蛋白进行纯化,制备抗体,并对抗体效价进行ELISA检测及抗体特异性的Western blot分析。【结果】重组蛋白GST-Rig-Ⅰ能在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白GST-Rig-Ⅰ纯化和洗脱后分子质量为130 ku,纯度>90%,制备的抗体效价达到1∶625 000,并且能够识别在原核表达系统以及真核细胞内表达的小鼠Rig-Ⅰ蛋白。【结论】建立的表达系统能够表达重组蛋白GST-Rig-Ⅰ,制备的抗体具有良好的免疫特异性。

基于生物信息学分析维甲酸诱导蛋白在胃癌组织的表达及其临床意义

目的观察维甲酸诱导蛋白(RAI14)在胃癌中的表达并探讨其预后预测价值及临床意义。方法通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载375例胃癌转录组数据、32例正常胃组织转录组数据及临床相关参数, 利用Wilcoxon秩和检验分析RAI14 mRNA的表达差异, 采用卡方检验分析RAI14表达量与临床病理特征的相关性。通过基因表达交互网站(GEPIA)、生存分析数据库(K-M plotter)及单因素回归分析胃癌患者预后影响因素。其中, 采用Cox回归模型进行单因素和多因素分析。同时, 通过R语言分析基因RAI14的相关通路, 探索其在胃癌中的潜在机制。此外, 通过TIMER数据库分析RAI14 mRNA表达水平与胃癌微环境中免疫细胞的相关性。结果 RAI14 mRNA在胃癌组织中的表达水平显著高于正常组织[4.549(4.037, 5.101)比3.109(2.335, 3.983), Z=16.8, P<0.01], 其表达量与肿瘤分化程度呈正相关(χ2=15.817, P<0.05);TCGA数据库及K-M plotter数据库分析显示胃癌组织中RAI14高表达患者预后差(Log-rank:P<0.05);多因素分析结果显示RAI14表达(风险比=1.718, 95%可信区间:1.159~2.546, P<0.01)是影响胃癌预后的独立因素;京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析结果显示RAI14参与了神经活性配体-受体相互作用通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路、钙离子信号通路等相关通路;TIMER数据库分析RAI14 mRNA表达水平与胃癌微环境中的M2型巨噬细胞浸润程度呈正相关(相关系数r=0.441, Spearman’s:P<0.05)。结论 RAI14 mRNA在胃癌组织中高表达, 且与胃癌患者的不良预后密切相关, 可作为胃癌预后的独立危险因子, 其可能通过神经活性配体-受体相互作用通路、PI3K-Akt信号通路、钙离子信号通路等相关通路在胃癌中发挥作用, 同时RAI14可能与胃癌微环境中的M2型巨噬细胞相关。

RIG-Ⅰ、USP5在卵巢上皮性癌组织中的表达水平及预后意义

目的 探讨维甲酸诱导基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)、泛素特异性肽酶5(USP5)在卵巢上皮性癌组织中的表达水平及预后意义。方法 选取98例卵巢上皮性癌组织样本为病例组,同期98例正常卵巢组织为对照组。免疫组化法测定两组RIG-Ⅰ、USP5表达水平。单因素及多因素Cox回归分析RIG-Ⅰ、USP5表达水平与卵巢上皮性癌患者临床预后的关系。结果 病例组RIG-Ⅰ、USP5表达阳性率均高于对照组(P<0.05)。卵巢上皮性癌患者RIG-Ⅰ、USP5表达与肿瘤最大径、TNM分期、肿瘤浸润、分化程度、淋巴结转移、复发率相关(P<0.05)。RIG-Ⅰ、USP5阳性的卵巢上皮性癌患者5年生存率均分别低于RIG-Ⅰ、USP5阴性的卵巢上皮性癌患者(P<0.05)。单因素分析显示:肿瘤最大径≥2 cm、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、浸润深度≥1 cm、分化程度高、淋巴结转移、复发、RIG-Ⅰ阳性、USP5阳性的卵巢上皮性癌患者5年生存率分别低于肿瘤最大径<2 cm、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、浸润深度<1 cm/无浸润、分化程度低、无淋巴结转移、无复发、RIG-Ⅰ阴性、USP5阴性的卵巢上皮性癌患者(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示:TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、分化程度高、RIG-Ⅰ和USP5表达阳性均是影响卵巢上皮性癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论 RIG-Ⅰ、USP5与卵巢上皮性癌患者临床病理特征相关;RIG-Ⅰ、USP5阳性表达是卵巢上皮性癌预后危险因素。

维甲酸诱导基因Ⅰ和慢性丙型肝炎的研究进展

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）急性感染期一般是无症状的，大多数感染者不能清除该病毒容易发展成慢性感染，少部分感染者甚至发展为肝硬化、肝癌。传统的治疗方法是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林方案，但抗病毒疗效不佳且不良反应较大，这可能与HCV能够通过多种机制逃避宿主的免疫反应有关。固有免疫应答是机体抵抗病原微生物的第一道防线，维甲酸诱导基因Ⅰ（Retinoic acid inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ）作为模式识别受体，在识别HCV病毒，启动免疫应答中发挥重要作用。

维甲酸诱导基因G抑制肿瘤细胞增殖的分子机制研究

目的探讨维甲酸诱导基因G（RIG—G）抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。方法应用转染实验、Western印迹法、免疫共沉淀和免疫荧光共定位等技术验证RIG—G蛋白与JAB1蛋白之间的相互作用，并研究RIG—G蛋白对JAB1蛋白功能的影响。结果RIG—G蛋白可以与JAB1蛋白发生相互作用，并影响JAB1蛋白在细胞内的定位和分布。实验发现，在NIH3T3细胞中单独转染JAB1时，JAB1蛋白在细胞核和细胞质内呈弥散分布，而当与RIG—G共同转染后，JAB1蛋白在细胞核内的含量明显减少，而改变为主要在胞质内分布，并与RIG—G蛋白发生部分共定位。此外，RIG—G蛋白还具有抑制JAB1对细胞周期抑制因子p27的辅助降解功能。结论RIG—G可以通过和JAB1的相互作用，使后者部分滞留在细胞质内，从而影响JAB1发挥正常功能，干扰其对p27的辅助降解，维持细胞内p27的稳定性，促进细胞退出增殖周期，抑制细胞增殖。

RIG-Ⅰ与干扰素信号通路的关系

目的研究干扰素(IFNs)对维甲酸诱导Ⅰ型基因(RIG-Ⅰ)的调控作用,同时探讨RIG-Ⅰ对IFNs生物学效应的介导作用。方法Northern杂交和半定量RT-PCR检测小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、在IFNs作用前后RIG-Ⅰ基因的表达。MTT比色法和细胞病变抑制法比较野生型和RIG-基因剔除(RIG-Ⅰ-/-)小鼠的MEFs在IFNs作用前后的生长情况和抗病毒活性。结果IFN-γ、IFN-β均能上调小鼠MEFs中RIG-Ⅰ的表达;100 U/mL IFN-γ处理后,野生型小鼠MEFs的生长抑制较RIG-Ⅰ-/-小鼠的MEFs明显;RIG-Ⅰ缺失后,IFN-β对细胞病毒感染的保护作用较野生型明显减弱。结论RIG-Ⅰ是一新发现的介导干扰素细胞效应的基因,它可能通过调节细胞因子的产生参与干扰素介导的炎症反应。