乙型肝炎肝硬化患者辅助性T淋巴细胞17和调节性T淋巴细胞及维甲酸相关核孤儿受体γt和叉状头/翅膀状螺旋转录因子3 mRNA表达水平的变化及其临床意义研究

目的通过对乙型肝炎肝硬化患者外周血辅助性T淋巴细胞17(Th17)、调节性T淋巴细胞(Treg)及其特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)和叉状头/翅膀状螺旋转录因子3(Foxp3)mRNA表达水平的检测探讨其临床意义。方法选取2015年7—12月昆明医科大学第一附属医院诊治的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者64例,其中慢性乙型肝炎(CHB)患者21例(CHB组)、代偿期肝硬化(CLC)患者21例(CLC组)、失代偿期肝硬化(DCLC)患者22例(DCLC组)。同期选取本院体检健康者20例为对照组。收集研究对象一般资料〔性别、年龄及丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)〕;应用流式细胞术检测研究对象外周血Th17、Treg表达率,计算Th17/Treg比值;应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-q PCR)法测定外周血RORγt、Foxp3 mRNA表达水平。结果 4组年龄、ALT、AST、TBIL比较,差异有统计学意义(P<0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值均高于对照组(P<0.05);DCLC组Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值均高于CHB组,Th17表达率及Th17/Treg比值均高于CLC组(P<0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05);DCLC组RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平均高于CHB组、CLC组(P<0.05)。CHB组、CLC组、DCLC组外周血Th17表达率与RORγt mRNA表达水平均呈正相关(P<0.05);CHB组、CLC组、DCLC组外周血Treg表达率与Foxp3 mRNA表达水平均呈正相关(P<0.05);CHB组、CLC组、DCLC组外周血Th17表达率、RORγt mRNA表达水平与ALT呈正相关(P<0.05);CHB组外周血Foxp3mRNA表达水平与ALT呈正相关(P<0.05);CHB组RORγt mRNA表达水平、Foxp3 mRNA表达水平与AST、TBIL呈正相关(P<0.05)。结论 Th17、Treg及其特异性转录因子RORγt、Foxp3可能与乙型肝炎肝硬化患者的疾病进展与肝功能有关。

白细胞介素-17和维甲酸相关核孤儿受体γt在小鼠真菌性角膜炎中的表达

背景CD4＋效应T细胞（Th1／Th2）的平衡模式以往常用于解释真菌感染性疾病的免疫机制。近年来发现，除Th1和Th2细胞亚群外，Th17细胞亚群也参与抗真菌感染的免疫应答，但其在真菌性角膜炎中的作用却鲜有研究。目的探讨白细胞介素-17（IL-17）及Th17特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt（RORγt）在真菌性角膜炎中的表达变化及其意义。方法将清洁级BALB／c小鼠96只按随机数字表法随机分为真菌性角膜炎模型组和损伤对照组，真菌性角膜炎模型组小鼠采用角膜表面镜术辅助上皮刮除并层间注入1×10^6CFU／ml真菌菌液5μl法建立小鼠茄病镰刀菌性角膜炎模型，损伤对照组在角膜表面镜术辅助上皮刮除后层间注入等体积（5111）的PBS液。采用质量分数10％KOH湿片法检查菌丝，部分用接种法进行真菌培养并鉴定菌种，另一部分进行细菌培养以排除细菌污染。于造模后第1、3、5、7天在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜炎症的变化特点，参照Wu和Hu的方法对角膜炎症进行评分。分别于造模后第1、3、5、7天处死小鼠并获取角膜组织行苏木精一伊红染色，观察角膜组织的病理改变。采用real—timePCR技术检测IL-17mRNA及其特异性转录因子RORγtmRNA的表达水平，并用ELISA法检测IL-17蛋白在角膜组织中的表达。结果造模后第1、3、5、7天角膜的炎症评分分别为（3．2±0．8）、（6．6±1．1）、（9．4±1．1）、（6．8±0．8）分，差异有统计学意义（F=89．786，P=0．010），其中第3天和第7天角膜炎症评分明显高于第1天，但低于第5天，差异均有统计学意义（P〈0．05）；角膜的组织病理学检测炎性细胞浸润情况与角膜炎症评分变化趋势一致。造模后第3、5、7天，IL-17mRNA在真菌性角膜炎模型组小鼠角膜的表达分别为4．12±0．73、20．72±1．81、14．16±1．88，高于损伤对照组的0．35±0．17、0．28±0．09、0．22±0．09，差异均有统计学意义（P〈0．01），且组内比较第5天时表达量高于第1、3、7天值，差异有统计学意义（P〈0．01），真菌性角膜炎模型组IL-17蛋白在造模后第1、3、5、7天的表达量均明显高于损伤对照组，差异均有统计学意义（P〈0．叭）。真菌性角膜炎模型组各时间点RORγt mRNA在角膜组织中的表达变化与IL-17mRNA的表达趋势一致（P〈0．01）。结论IL-17及其特异性转录因子RORγt在真菌性角膜炎局部组织中的表达量均上调，其表达量变化的趋势与其炎症反应程度相关，推测Th17在真菌性角膜炎的免疫反应中发挥重要作用。

维甲酸相关核孤儿受体γt和4-1BB/4-1BBL在口腔扁平苔藓中的表达及意义

目的研究口腔扁平苔藓(OLP)患者外周血中维甲酸相关核孤儿受体γ(tRORγt)和4-1BB/4-1BBL mRNA的表达。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测30例OLP患者和30例健康人外周血中RORγt和4-1BB/4-1BBL的基因表达水平。结果在OLP患者中,RORγt、4-1BB、4-1BBL mRNA的表达水平显著高于对照组(P<0.05),结果经2-ΔΔCT转换后,OLP组3种基因mRNA表达水平分别是健康对照组的3.087、3.320和4.005倍。RORγt和4-1BB mRNA的表达水平无明显相关性(P>0.05),4-1BB和4-1BBL mRNA表达水平呈正相关(r=0.455 0,P<0.05)。结论RORγt和4-1BB/4-1BBL在OLP的发病中起了一定作用。

Th17转录因子RORγt和BATF及Th17相关细胞因子在中性粒细胞亚型哮喘发病中的作用

目的:检测中性粒细胞亚型哮喘(NA)患者痰上清中辅助性T细胞17(Th17)特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、B细胞转录激活因子(BATF)及外周血中Th17细胞相关细胞因子白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素17(IL-17)和白细胞介素22(IL-22)表达水平,探讨其在NA发病中的作用。方法:以56例支气管哮喘患者为研究对象,4.5%生理盐水雾化诱导痰,经细胞MGG染色进行哮喘的炎症亚型分型,分为嗜酸性粒细胞亚型哮喘(EA)组(26例)和NA组(30例),以常规体检者为健康对照组(NC组,28人)。实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测痰上清中BATF和RORγt mRNA表达水平。空腹抽取各组研究对象肘静脉血10mL,Ficoll密度梯度离心后分离外周血单个核细胞(PBMC),ELISA法测定血清中IL-8、IL-17和IL-22蛋白表达水平,流式细胞术检测PBMC中Th17细胞(CD4+IL-17+细胞)的百分率。结果:与NC组和EA组比较,NA组患者血清中IL-8、IL-17和IL-22表达水平均明显升高(P<0.05);与NC组比较,EA组患者血清中IL-8、IL-17和IL-22表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组和EA组比较,NA组患者痰上清中BATF和RORγt mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。与NC组和EA组比较,NA组患者PBMC中Th17细胞百分率均明显升高(P<0.01);与NC组比较,EA组患者PBMC中Th17细胞百分率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:IL-17转录因子RORγt和BATF参与了NA患者气道炎症发生过程,且Th17细胞及其相关细胞因子IL-17和IL-22的异常表达与NA的全身反应有关联。

哮喘患儿外周血单个核细胞瘦素与RORγt和Foxp3表达的关系

目的:探讨哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)分泌的瘦素水平变化及其与Th17特异性转录因子维甲酸相关孤儿核受体γt(RORγt)和Foxp3+调节性T细胞(Treg)特异性转录因子叉头状转录因子p3(Foxp3)表达的关系。方法:选取2018年6月-2020年6月本院收治的25例哮喘患儿设为哮喘组。根据哮喘组患儿疾病所处的时期不同,分为发作期和缓解期。对哮喘发作期儿童经规则联合吸入糖皮质激素/长效β2受体激动剂(ICS/LABA)治疗后定期随访,无症状和体征超过3个月以上作为缓解期。选取同期在本院体检25例的健康儿童为对照组。比较哮喘组发作期和缓解期及对照组的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平,并分析哮喘组发作期患儿瘦素与PBMC的FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及RORγt mRNA与Foxp3 mRNA的相关性。结果:对照组、哮喘组发作期和缓解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。哮喘组发作期的瘦素、RORγt mRNA相对表达量均高于对照组和哮喘组缓解期,FEV1%、Foxp3 mRNA均低于对照组和哮喘组缓解期,差异均有统计学意义(P<0.01)。对照组和哮喘组发作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较,差异均无统计学意义(P>0.01)。哮喘组患儿发作期PBMC培养上清液瘦素浓度与PBMC的RORγt mRNA呈正相关(r=0.884,P<0.01);与PBMC的Foxp3 mRNA呈负相关(r=-0.926,P<0.01);与FEV1%呈负相关(r=-0.936,P<0.01);Foxp3 mRNA与RORγt mRNA呈负相关(r=-0.854,P<0.01)。结论:哮喘患儿PBMC分泌的瘦素与RORγt mRNA呈正相关,与Foxp3 mRNA呈负相关。

急性脑梗死患者外周血Th17细胞及其相关因子的表达变化

目的探讨急性脑梗死患者外周血Th17细胞、核转录因子维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)和白细胞介素17(IL-17)的变化规律。方法连续选取60例急性脑梗死患者及50名体检健康者为对照组。对发病后6、24 h和3、7、14 d的急性脑梗死患者,均抽取3.0 ml全血,抽取对照组3.0 ml全血,分别采用流式细胞仪、实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血Th17细胞百分率、RORγt mRNA表达水平及IL-17水平。结果①急性脑梗死后6 h,Th17细胞百分率、RORγt mRNA表达水平及IL-17水平均高于对照组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。②急性脑梗死后24 h和3、7 d,患者的Th17细胞百分率分别为(0.98±0.19)%、(1.25±0.23)%、(1.09±0.21)%,高于对照组(0.84±0.16)%,差异有统计学意义(均P<0.01)。③急性脑梗死后24 h和3、7 d患者外周血RORγt mRNA表达水平分别为0.41±0.16、0.49±0.19、0.42±0.17,高于对照组0.29±0.11,差异有统计学意义(均P<0.01)。④急性脑梗死后24 h和3、7、14 d患者血清IL-17水平分别为(34±15)、(68±29)、(41±21)、(32±14)ng/L,高于对照组的(21±11)ng/L,差异均有统计学意义(均P<0.01)。⑤急性脑梗死后14 d,Th17细胞百分率、RORγtmRNA表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论急性脑梗死患者外周血中Th17细胞及IL-17水平增高,Th17细胞可能参与了急性脑梗死发生、发展过程。

多发性硬化患者Th17转录因子及相关细胞因子表达的研究

目的检测多发性硬化(multiple sclerosis,MS)患者辅助性T细胞17(interleukin 17,Th17)特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoicr acid-related orphanreceptorγt,RORγt)、B细胞转录激活因子(B cell activating transcription factor,BATF)及细胞因子表达水平,探讨其在MS发病中的作用。方法纳入缓解-复发型MS急性期患者及健康对照组各53例为研究对象,抽取MS患者治疗前、治疗4周后及健康人的空腹静脉血。检测血清中白细胞介素10(interleukin,IL)-10、IL-17和IL-27蛋白表达水平,PBMC中Th17细胞(CD4+IL-17+细胞)的百分率和BATF和RORγt mRNA表达水平。结果与健康对照组比较,MS患者治疗前血浆IL-17[(31.01±8.41)ng/L,(P<0.05)]水平较高,而IL-10、IL-27[(53.74±13.14)、(138.35±17.48)ng/L]水平均较低,外周血PBMC中BATF和RORγt m RNA[(2.97±0.57)、(4.67±0.81),(均P<0.05)]表达水平均升高,Th17细胞(CD4+IL-17+细胞)百分率[(1.87%±0.37%),(P<0.05)]明显升高;与治疗前比较,MS患者治疗4周后血浆IL-17水平降低[(27.39±7.92)ng/L,(P<0.05)],相反IL-10、IL-27[(79.36±10.91)、(185.08±18.07)ng/L]水平均升高,BATF和RORγt mRNA表达水平[(1.73±0.34)、(2.03±1.04),(均P<0.05)]均降低,Th17细胞(CD4+IL-17+细胞)百分率[(0.83%±0.19%),(P<0.05)]明显降低;治疗后与健康对照组比较,IL-10与IL-17仍偏高(均P<0.05),而IL-27偏低(P<0.05),BATF和RORγt mRNA表达水平均升高,Th17细胞(CD4+IL-17+细胞)百分率明显升高(均P<0.05)。结论在MS患者外周血发现有Th17转录因子RORγt和BATF及Th17细胞及其相关细胞因子IL-10、IL-17和IL-27的改变。

小鼠念珠菌性阴道炎中维A酸相关孤儿受体、白细胞介素17表达

目的探讨Th17／白细胞介素（IL）17轴在小鼠念珠菌性阴道炎发病中作用。方法120只雌性BALB／c小鼠随机分为雌激素感染组（Ei）、雌激素非感染组（En）、对照感染组（Ci）和对照非感染组（Cn）。Ei、En组在阴道接种前3d于后腿皮下注射雌二醇0．05mg，而Ci、Cn组皮下注射灭菌大豆油0．1ml，以后隔日注射1次直至实验结束；Ei、Ci组在接种日在阴道内接种白念珠菌悬液10μL（5×10^4个孢子），而En、Cn组阴道内注入10μl无菌磷酸盐缓冲液。接种后3、7、14d，每组于各时间点分别随机取10只小鼠处死，完整切取阴道组织作液氮冷冻或石蜡包埋，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹和免疫荧光染色分别检测阴道组织中维A酸相关孤儿受体（ROR）γt、RORα、IL-17mRNA、蛋白表达及免疫荧光强度。结果激光共聚焦显微镜显示，En、Cn组中RORγt、RORα和IL—17主要表达于阴道固有膜及血管中炎症细胞，Ci组中主要表达于黏膜上皮及其表面附着的菌丝、固有膜及血管中炎症细胞，Ei组中则广泛分布于黏膜上皮、固有膜及血管中炎症细胞、阴道腔和黏膜上皮中内吞菌丝。qRT-PCR和免疫荧光检查显示，En、Ci和Ei组中RORγt、RORα、IL-17mRNA表达及其免疫荧光强度在相同时间点均显著高于Cn组（均P〈0．05），且Ei组显著高于En、ci组（P〈0．05）；除Cn组外，其余各组中RORγt、RORα、IL-17mRNA表达及其免疫荧光强度均随时间延长有增加的趋势，其中RORγt、RORαmRNA和免疫荧光强度及IL-17mRNA一般在14d时最高，而IL-17免疫荧光强度在7d时最高（P〈0．05）。Western印迹显示，Ci、Ei组中RORγt和IL-17蛋白表达在相同时间点均明显高于Cn、En组（RORγt：F组别=45．685，P〈0．001；IL-17：F组别=29．655，P〈0．01），其中H组表达水平最高（P〈0.05），而Cn、En组表达差异无统计学意义（P〉0．05）；Ci、Ei组中二者表达均在感染后7d明显上调，14d无显著增加（RORγt：Fs时间=13．137，P〈0．001；IL-17：F时间=11．182，P〈0．001）。结论阴道念珠菌感染可上调RORγt、RORα、IL-17表达，提示Th17／IL-17轴可能参与BALB／c小鼠念珠菌性阴道炎发生。

转录因子RORγt在胃癌中的表达及临床意义

目的:探讨胃癌组织中RORγt mRNA的表达水平并观察其与临床病理组织分化程度的相关性。方法:收集59例胃癌患者胃癌组织和癌旁组织标本,采用实时荧光定量PCR的方法检测RORγt mRNA的表达水平。结果:胃癌组织RORγt表达水平为(1.26±0.42),明显高于癌旁组织(0.35±0.14),且与肿瘤组织分化程度相关,即RORγtmRNA表达水平越高,分化越低。结论:胃癌患者肿瘤微环境存在RORγt的高表达,表明RORγt可能参与了胃癌的免疫病理进程。

补肾平喘膏方对支气管哮喘大鼠Th17/Treg平衡的影响

目的观察支气管哮喘(哮喘)大鼠肺组织中维甲酸受体相关孤儿受体(RORγt)和叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)的变化情况以及补肾平喘膏方对其的影响,以探讨补肾平喘膏方防治哮喘的作用机制。方法 60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、西药组、膏方预防组、膏方治疗组和膏方防治(预防+治疗)组,每组10只。除正常对照组外,其余各组大鼠以卵蛋白(OVA)致敏并诱发哮喘模型。采用地塞米松或膏方治疗(正常组与模型组除外)后,RT-PCR法检测肺组织中RORγt和Foxp3的mRNA表达情况。结果模型组肺组织Foxp3 mRNA表达低于正常组(P<0.01),经膏方干预的各组大鼠肺组织Foxp3 mRNA表达升高(P<0.05),与正常组表达相似(P>0.05),膏方各组组间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组肺组织RORγt mRNA表达高于正常组(P<0.01),经膏方干预的各组大鼠肺组织RORγt mRNA明显降低(P<0.05),膏方各组组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论补肾平喘膏方可以通过调节哮喘大鼠RORγt/Foxp3平衡,改善Th17/Treg的失衡状态,从而防治哮喘。

系统性红斑狼疮患者外周血CD4＋T细胞来源瘦素水平及意义

目的 探讨外周血CD4＋T细胞来源瘦素在系统性红斑狼疮发生中的作用.方法 收集2011年1月～2012年12月确诊的27例系统性红斑狼疮患者和25名健康对照外周血标本,分离PBMC,用CD4＋T细胞免疫磁珠分离CD4＋T细胞,体外进行培养,免疫酶联吸附试验（ELISA）检测上清液及血浆中瘦素水平.采用实时定量PCR（qRT-PCR）方法检测PBMC中维甲酸相关孤儿核受体γt（RORγt）相对表达量.统计学处理采用非配对t检验和Spearman相关分析.结果 系统性红斑狼疮患者CD4＋T细胞培养上清液中瘦素水平显著高于健康对照组（57.8±12.9 pg/ml vs 31.9±6.7 pg/ml,t= 9.524,P〈0.01）,而血浆中瘦素水平差异则无统计学意义（16.5±4.7 pg/ml vs 13.9±3.8 pg/ml,t= 1.912,P〉0.05）.系统性红斑狼疮患者CD4＋T细胞培养上清液中瘦素水平与RORγt相对表达量呈正相关（r=0.681,P〈0.05）,血浆中瘦素与RORγt相对表达相关性不明显（r=0.294,P=0.136）.结论 在系统性红斑狼疮的发生发展过程中,CD4＋T细胞来源瘦素诱导RORγt表达,促进Th17细胞的致病作用.

GDNF促进帕金森病大鼠模型脑内移植的中脑源神经干细胞表达Pitx3、Nurr1和TH

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)作用下,中脑源神经干细胞(mNSCs)在帕金森病(PD)大鼠模型纹状体移植区表达垂体同源盒家族因子3(Pitx3)、孤儿核受体相关因子1(Nurr1)和酪氨酸羟化酶(TH)的变化。方法:mNSCs单独移植组、mNSCs+GDNF移植组和生理盐水假手术组的PD大鼠模型,移植4周和8周后采用免疫荧光和Western Blot方法检测移植区Pitx3、Nurr1和TH的表达。结果:(1)mNSCs单独移植组和mNSCs联合GDNF移植治疗组在移植后4周、8周移植区均有Pitx3,Nurr1和TH表达,mNSCs单独移植组较少表达Pitx3,Nurr1;(2)Western Blot检测显示联合移植组移植区Pitx3、Nurr1和TH表达量高于单独移植组,其中联合移植组4周表达量最高(P<0.05)。结论:GDNF有促进PD大鼠模型脑内移植的mNSCs表达Pitx3、Nurr1和TH的作用。

pitx3和nurr1基因在不同年龄大鼠不同脑区的表达变化

目的:探讨正常不同年龄SD大鼠不同脑区pitx3、nurr1基因的表达变化。方法:使用RT-PCR、免疫印迹法和免疫荧光方法检测pitx3、nurr1基因在正常不同年龄SD大鼠不同脑区转录与翻译水平的表达。结果:RT-PCR、免疫印迹法检测显示,pitx3、nurr1基因在各年龄组大鼠中脑、大脑皮质、海马、纹状体、嗅球和下丘脑均有表达,其中在海马和中脑表达较高;在各年龄组中新生组表达最高,并随着年龄的增长表达呈下调趋势;免疫荧光检测E16.5 d组和新生组的中脑和海马区观察到有大量Pitx3或Nurr1单标细胞和Pitx3/TH或Nurr1/TH双标细胞。结论:pitx3、nurr1基因的表达不仅与中脑多巴胺能神经元,而且可能与儿茶酚胺类神经元的发育和生存维持有关;老年期pitx3、nurr1基因表达下降可能与脑老化和神经退行性变疾病,如帕金森病和老年性痴呆等有关。

Foxp3/Treg与RORγt/Th17失衡在慢性乙型肝炎病毒感染中的作用

在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染期间可见到广泛的免疫介导的肝损伤. HBV免疫清除的失败从而导致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB),并大大增加肝硬化和肝细胞癌的风险. T淋巴细胞在HBV感染中的免疫反应起重要作用,尤其是调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)和辅助性T细胞17(helper T cell 17, Th17)失衡的问题,二者的平衡失调是HBV持续感染与肝脏炎性损伤的重要机制.为了更好地揭示潜在的机制,在本综述中,我们系统地回顾了Treg和Th17,讨论了在HBV感染后Treg与Th17两者之间的关系,并对特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptorγt, RORγt)和叉头/翅膀状螺旋转录因子3(forkhead/winged helix family transcription factor 3, Foxp3)两者之间的变化,随着近几年对HBV免疫靶向治疗研究的不断深入,Foxp3/Treg与RORγt/Th17的平衡似乎对HBV的感染至关重要,以此为契机可以为CHB的治疗提供新的思路.

转录因子Pitx3和Nurr1在中脑多巴胺能神经元终末分化中的表达特点

目的:探讨转录因子垂体同源盒家族因子3(Pitx3)和孤儿核受体相关因子1(Nurr1)在多巴胺(DA)能神经元终末分化中的表达特点。方法:采用免疫荧光方法检测体外培养的中脑源性神经干细胞(mNSCs)诱导分化后和大鼠胚胎发育至出生腹侧中脑Pitx3、Nurr1和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果:(1)体外培养的mNSCs诱导分化48 h的Map-2阳性细胞不表达Pitx3、Nurr1和TH;分化7 d的TH阳性细胞均表达转录因子Pitx3和Nurr1;(2)在大鼠腹侧中脑黑质(SN)、腹侧被盖区(VTA)和中缝背核(DRN)可见大量TH与Pitx3(或Nurr1)共表达的神经元;(3)Pitx3和Nurr1阳性细胞主要分布于E16.5、P0大鼠SN、VTA和DRN区,其中Pitx3阳性细胞还少量分布于腹侧中脑非DA能神经元区域,Nurr1阳性细胞在腹侧中脑分布范围较Pitx3更广泛。结论:转录因子Pitx3、Nurr1在中脑DA能神经元的终末分化和生存维持中起重要作用。

miR-149-5p对变应性鼻炎小鼠Notch1表达和Treg/Th17免疫平衡的影响

目的:探讨miR-149-5p对变应性鼻炎(AR)小鼠神经源性位点缺口同系物蛋白1(Notch1)表达和调节性T细胞(Treg)/辅助性T细胞17(Th17)失衡的影响。方法:12只BALB/c小鼠,3只为正常组,余9只小鼠采用卵清蛋白(OVA)和氢氧化铝[Al(OH)3]建立AR模型,再随机均分为模型组(仅造模)、miR-149-5p激动剂对照组(鼻内滴注miR-149-5p agomir阴性对照)及miR-149-5p激动剂组(鼻内滴注miR-149-5p agomir);采用行为学评分考察各组各组小鼠过敏症状、苏木精/伊红染色(HE)分析各组小鼠鼻黏膜病理学变化、实时荧光定量PCR(q PCR)检测各组小鼠鼻黏膜组织miR-149-5p,采用酶联免疫吸附法(ELISA)分析各组小鼠血清免疫球蛋白E(Ig E)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)水平,采用蛋白印迹法检测各组小鼠鼻黏膜组织Notch1、维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)及叉头状螺旋转录因子3(Foxp3)蛋白表达;利用miRDB网站预测miR-149-5p与Notch1 3’-UTR结合位点,构建Notch1 3’-UTR区野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告载体,转染293T细胞,设置NC+Notch1(MUT)组、miR-149-5p agomir+Notch1(MUT)组、NC+Notch1(WT)组及miR-149-5p agomir+Notch1(WT)组,采用双荧光素酶实验分析并计算荧光素酶相对活性。结果:与模型组比较,miR-149-5p激动剂组小鼠行为学评分明显下降,鼻黏膜炎症反应减轻,上皮结构趋于完整,miR-149-5p的表达显著增加,血清中Ig E、IL-6水平下降,IL-10水平升高,Foxp3蛋白的表达增加,Notch1和RORγt蛋白的表达减少(P <0. 05或P <0. 01);miRDB网站预测miR-149-5p与Notch1 3’-UTR存在互补位点,双荧光素酶实验结果显示,miR-149-5p agomir+Notch1(WT)组的荧光素酶相对活性较NC+Notch1(WT)组降低(P <0. 05)。结论:miR-149-5p可能通过靶向Notch1调节Foxp3和RORγt蛋白表达,影响Treg/Th17细胞平衡,从而改善AR小鼠鼻部过敏症状。

病毒性心肌炎小鼠不同时期心肌组织转录因子ROR-γt的表达

目的观察Th17细胞特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptorγt,ROR-γt)在柯萨奇病毒B3(coxsackie virus B3,CVB3)诱导的病毒性心肌炎小鼠不同时期心肌组织中的表达变化,初步探讨ROR-γt在病毒性心肌炎发病中的作用。方法雄性BALB/c小鼠腹腔注射CVB3建立病毒性心肌炎小鼠模型(实验组),对照组小鼠腹腔注射等量的磷酸盐缓冲液,按注射后第0、1、2、3、4、6周分为6个时点亚组,每个时点亚组至相应时间取小鼠心脏,苏木精-伊红染色观察心肌病理改变,半定量反转录聚合酶链反应测定小鼠心肌组织ROR-γt mRNA的表达,Western-Blotting测定小鼠心肌组织ROR-γt蛋白的表达。结果苏木精-伊红染色证实病毒性心肌炎模型构建成功。实验组小鼠中,1周亚组ROR-γt mRNA及其蛋白的表达较0周亚组升高,4周亚组表达最高,6周亚组表达低于4周亚组但仍高于0周亚组;实验组各亚组ROR-γt mRNA及其蛋白的表达与相应时间对照组各亚组比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论Th17细胞特异性转录因子ROR-γt在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中呈高表达,且其变化趋势与Th17细胞改变趋势一致,提示ROR-γt通过参与病毒性心肌炎中Th17细胞的分化,可能参与病毒性心肌炎的免疫发病过程。

急性肺损伤患者外周血Th17细胞水平及功能的研究

目的探讨Th17细胞在急性肺损伤发病中的作用。方法以10名急性肺损伤患者和10名健康志愿者为研究对象,分别留取外周血标本。利用RT-PCR技术检测外周血中淋巴细胞所表达的RORγt mRNA的相对量,流式细胞仪检测外周血中Th17细胞的比例,ELISA法检测血浆中IL-17的水平。结果 RORγt mRNA在急性肺损伤组的表达水平(0.56±0.08)高于对照组(0.19±0.05),差异显著(P<0.01)。Th17细胞在急性肺损伤组的比例(32.60±5.51)%高于对照组(12.29±1.71)%,差异有统计学意义(P<0.01)。IL-17在急性肺损伤组的浓度(87.33±6.08)pg/ml明显高于对照组(52.71±3.19)pg/ml,P<0.01。结论 Th17细胞与急性肺损伤具有相关性,可能通过分泌IL-17来上调炎症反应,加重炎症反应的失控。

扶正口服液通过STAT3-RORγt信号通路对胃癌小鼠T h17细胞的调控作用

目的:探讨扶正口服液通过信号转导与转录激活因子3(STAT3)-维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)信号通路对胃癌小鼠辅助性T细胞17(T h17)的调控作用。方法:将KM小鼠按随机数字表法分为空白组,阳性对照(5-FU)组,低、中、高剂量组(扶正口服液剂量分别为0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL/10 g),每组8只。皮下移植SCG-7901造模,干预28 d后,检测小鼠瘤体体积,肿瘤抑制率,肿瘤组织STAT3和RORγt信使RNA(mRNA)及蛋白的表达,血清白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-22(IL-22)、白细胞介素-6(IL-6)水平。结果:给药后,5-FU组,低、中、高剂量组瘤体体积均小于空白组,5-FU组瘤体体积均小于低、中剂量组,5-FU组瘤体生长抑制率均高于低、中剂量组(P<0.05)。中、高剂量组STAT3、RORγt mRNA表达量均低于空白组、5-FU组、低剂量组,(P<0.05)。中、高剂量组STAT3、RORγt蛋白表达均低于空白组(P<0.05)。低、中、高剂量组血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于空白组,中、高剂量组血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于5-FU组和低剂量组(P<0.05)。结论:高剂量扶正口服液可下调STAT3、RORγt的表达,进而抑制胃癌小鼠Th17的分化发挥抑瘤作用。

转录因子RORγt对T细胞亚群产生IFN-γ的调控作用

目的:探讨转录因子维A酸相关孤独受体γt(RORγt)对T细胞亚群产生IFN-γ的调控作用。方法:健康成人外周血单个核细胞用CD3单克隆抗体和IL-2激活和扩增T细胞,活化T细胞用脂质体法转染人工合成的RORγt基因特异性短干扰RNA(siRNA)序列3个片段(RORγt-siRNA-982,-1026,-1197),RT-PCR半定量法检测活化T细胞转染siRNA后RORγt基因表达,流式细胞仪检测不同T细胞亚群产生IFN-γ细胞的比例。结果:活化T细胞转染RORγt-siRNA后,对RORγt基因表达的检测显示,RORγt-siRNA-982序列无抑制作用,而RORγt-siRNA-1026和-1197序列均有明显抑制作用。活化T细胞转染RORγt-siRNA-1026后,产生IFN-γ细胞百分数在CD4+T细胞(32.78±3.41)中,明显低于未转染组(44.54±1.75)(P<0.01)。结论:转录因子RORγt对T细胞,特别是对CD4+T细胞产生IFN-γ有正调控作用。