绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

一起绵羊支原体肺炎的诊治

近3年来,阿拉善左旗周边的新冠疫情复杂多变,畜间的呼吸系统传染性疫病也不断发生。现将一起绵羊支原体肺炎的防控情况报道如下:1发病情况2022年9月14日,阿拉善左旗动物疫病预防控制中心(简称旗动疫中心)接到巴彦浩特镇(简称巴镇)和超格图呼热苏木(简称超苏木)报告,称9月2日牧民从阿左旗某羊场调入的绵羊出现大量死亡。

绵羊支原体肺炎流行特点与诊治

绵羊支原体肺炎,又称绵羊传染性胸膜肺炎,是由绵羊肺炎支原体引起的一种高度接触性传染病。本病以咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质的增生性炎症为特征。1流行病学特点绵羊肺炎支原体可以侵害山羊和绵羊,一年四季均可发病,冬春季节羊感染的发病率和死亡率比夏秋季高。在自然状态下主要通过空气、飞沫经呼吸道感染发病。各日龄羊均可发病,1~2月龄羔羊发病率高,死亡率高。

舍饲绵羊支原体肺炎的诊断与防治

宁夏某种羊场引进一批种用杜泊绵羊,进场一周后羊群中出现个别羊只采食减少,动则喘,并伴有体温升高,按感冒治疗,但效果不佳,症状加重,此后3月内共发病25只羊,死亡9只,经确诊为绵羊支原体肺炎,现将诊断与防治过程介绍如下,以供参考。羊支原体性肺炎(mycoplasmal pneumonia of sheep and goats),又称羊传染性胸膜肺炎,是由支原体感染所引起绵羊和山羊的一种高度接触性传染病,病死率较高[1],以绵羊、山羊以咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质的增生性炎症为特征的呼吸道传染病[2]。

绵羊支原体肺炎中不同甘露(聚)糖结合凝集素基因型对肺组织病变的影响

为建立不同甘露(聚)糖结合凝集素(MBL)基因型绵羊支原体肺炎的动物疾病模型,本研究选择MBL外显子1中4种不同基因型共32只绵羊作为试验组,6只健康羊作为对照组,在人工感染绵羊肺炎支原体3周后全部迫杀,取肺脏组织做病理切片,以组织病理学评分确定肺部的炎症反应程度。不同MBL型绵羊的肺脏呈现不同程度病理改变,组织病理学评分结果为MBL A型和B型平均分为18.3和19.1,表现为重度病变;MBL D型平均分为12.3,为中度病变;MBL C型平均分为8.9,为轻度病变。本研究以组织病理学评分方法客观量化了不同MBL基因型肺部炎症反应的严重程度,根据评分结果推测MBL A型和B型为易感型,C型为抗性型。本研究利用组织病理学评分方法对其肺炎程度进行量化评价,为筛选绵羊支原体肺炎抗性基因型提供依据。

绵羊支原体肺炎研究进展

绵羊支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep,MPS)也称为绵羊传染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia),是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)引起的绵羊高度接触性传染病。1963年,Mackay等[1]首次在患病绵羊体内分离到MO;1972年,Carmichael等[2]正式将此支原体命名为绵羊肺炎支原体;1979年,Livingston等[3]从患病山羊体内同样分离到了MO。国内最早由胡景韶等[4]于1982年在四川发病绵羊肺脏中分离到MO,该病给我国绵羊和山羊养殖业造成了严重的经济损失。

贵州省绵羊支原体肺炎研究进展

从流行病学、临床症状、诊断技术、防治技术等方面对贵州省绵羊支原体肺炎的研究进展进行了总结,以期为该病的防控提供参考。

舍饲绵羊支原体肺炎诊断与防治

绵羊支原体肺炎是由肺炎支原体引发的绵羊特有的高度接触性传染性疾病。该种疾病被世界卫生组织划归为B类疫病,我国将其划归为二类动物疫病,临床上以纤维素性肺炎和胸膜肺炎为主要特征。舍饲养殖模式下,由于单位面积内的羊群养殖数量相对较多,不同年龄的羊群在相互接触中,由于抗病能力存在一定差异,易传播多种病原。不同性别和年龄的绵羊遭受到支原体危害后,表现的临床症状存在一定差异性。隐性患病病例的存在使养殖场反复流行该类疾病,造成的危害巨大。该文主要论述舍饲绵羊支原体肺炎的诊断和防治过程,以降低经济损失,提高治疗效果。

绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。

基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

绵羊肺炎支原体研究进展

【现状】绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)是引起绵羊和山羊呼吸系统疾病的主要病原之一,病羊以咳嗽、气喘、流鼻液、消瘦等为主要临床症状。【问题】由于该病原具有广泛的寄主范围,病程长,体外培养困难,对抗菌药物的敏感性难以测定,致使临床选药困难,用药依从性差。因此,目前该病防控缺乏便捷且行之有效的措施,具有较高的病死率,一旦发病对羊产业造成巨大经济损失。【对策】目前有效防控措施为疫苗免疫,但缺乏针对性强的商业化市售疫苗。根据目前抗病育种研究,可以针对绵羊肺炎支原体培育新抗病绵羊品种。【结论】疫苗防控是快速有效的防控措施之一,但由于流行病原无交叉保护性,且成本较高,无法满足新疆羊产业发展需要,因此,培育抗绵羊肺炎支原体的绵羊新品种十分必要且意义深远。

绵羊肺炎支原体致病机制研究进展

绵羊肺炎支原体是引起羊传染性胸膜肺炎的重要病原之一,是一种以咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎为特征的慢性呼吸道疾病,给羊养殖业造成了巨大的经济损失和动物生产力的下降。综合近期国内外关于绵羊肺炎支原体致病机制的文献报道,本文对Mo的黏附、免疫损伤机制进行了阐述,以期为我国绵羊支原体性肺炎的研究和防治提供参考。

宁夏地区绵羊肺炎支原体感染的流行情况调查

为初步掌握宁夏回族自治区绵羊(滩羊)感染绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)的流行情况,采用建立的Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,对2022-2023年间采集自宁夏地区不同县(区)的400份绵羊鼻拭子样本进行实时荧光定量PCR检测与分析,结果显示,宁夏地区的7个县(区),包括同心县、灵武县、平罗县、永宁县、贺兰县、利通区和盐池县等地的绵羊Mo的检测结果均有阳性。随机采集的绵羊鼻拭子400份中,检测出Mo阳性有329份,平均阳性检出率为82.25%。不同县(区)之间比较,同心县、灵武县、平罗县、永宁县、贺兰县、利通区和盐池县Mo阳性率分别为80.32%、93.42%、79.59%、78.18%、82.25%、80.43%和76.47%,其中灵武县的Mo阳性率最高,与其他几个县(区)的Mo检出率相比均差异极显著(P<0.01),盐池县最低。不同月龄之间比较,3~5月龄Mo检出率最高(100.00%),与1~2月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01);6~8月龄Mo检出率次之,与1~2月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01);1月龄以内Mo感染率最低(10.00%),与3~5月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01)。结果表明,所调查的宁夏地区7个羊养殖主要县(区)均有Mo感染,并且流行范围较广且阳性率高,其中滩羊在3~5月龄是Mo感染的高峰阶段。

绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。

绵羊肺炎支原体P110/LppT黏附素家族保守区的原核表达和免疫原性分析

绵羊肺炎支原体(Mo) NM2010株的P120蛋白与猪肺炎支原体(Mhp)的黏附素P110高度同源,同属于P110/LppT黏附素N端结构域家族。为了筛选用于研制广谱绵羊支原体肺炎疫苗的保护性抗原,本试验利用生物信息学方法对Mo NM2010株P120蛋白的保守区段、结构、B细胞抗原表位进行预测分析,并对P120基因的N端和C端2个保守区基因片段进行克隆、表达、可溶性分析和抗原特性分析;2个表达产物分别对兔进行免疫试验,用ELISA方法检测免疫兔血清抗体效价和IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子浓度。结果显示,P120蛋白N端有信号肽和1个跨膜螺旋,亚细胞定位在外膜,可能是一种外膜蛋白,P120蛋白N端和C端2个保守区段均有较多B细胞线性抗原表位,具有较好的抗原性;经序列测定证实,合成的P120-N和P120-C 2个基因片段的基因序列完全正确,长度分别为1 509 bp和741 bp,表达的重组蛋白分子质量分别为58.1 kDa和29.5 kDa;P120蛋白N端以可溶和包涵体2种形式存在,C端以包涵体形式存在,均具有良好的抗原性;新西兰大白兔经4次免疫后,重组蛋白P120-N组和重组蛋白P120-C组兔血清中均产生了特异性抗体IgG,效价分别为1∶512 000和1∶128 000;与阴性对照组相比,重组蛋白P120-N组和重组蛋白P120-C组兔血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ浓度均极显著升高(P<0.01)。结果表明,重组蛋白P120-N和P120-C可以诱导试验动物机体的体液免疫反应,P110/LppT黏附素家族保守区可以作为广谱绵羊支原体肺炎疫苗的候选蛋白。

宁夏某羊场绵羊肺炎支原体的分离鉴定及病理组织学观察

为了确定宁夏某羊场发生一起以体温升高、咳嗽、呼吸困难为临床特征且具有传染性的疾病的病原,采集濒死病羊的病理组织,应用细菌分离培养、分子生物学鉴定、病理组织学观察及免疫组织化学分析等方法对采集的病料进行病原检测和诊断。结果显示,细菌分离培养获得3株支原体分离株,分子进化分析发现其均属于绵羊肺炎支原体,与国际标准株Y-98的序列一致性为100%。病理组织学观察显示,肺泡上皮细胞坏死、增生,支气管管腔内和肺泡腔内大量炎性细胞浸润,支气管和气管黏膜上皮细胞坏死、脱落、固有层水肿、炎性细胞浸润。对不同脏器的免疫组织化学分析显示,绵羊肺炎支原体主要集中于肺脏和气管内,且肺脏的阳性组织百分比最高,其次是支气管和气管。结合疫病的流行病学调查,该羊场所发疾病为运输应激后感染绵羊肺炎支原体导致,该病原侵染并定植于肺脏、气管及支气管上皮细胞,引起羊严重的呼吸道病症。

绵羊肺炎支原体的研究进展

文章介绍了绵羊肺炎支原体的病原特征、致病性及致病机理、疫苗研制情况,并提出加强研究的方向,为该病的防治及疫苗开发提供参考。

绵羊肺炎支原体不同分离株的致病性比较

为研究不同绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)的致病性差异,筛选出致病性强的Mo菌株。通过间接免疫荧光技术检测不同Mo分离株(XJ15、XJ13、XJ22、1412、XJN)、标准株(Y98)对山羊气管上皮细胞(goat tracheal epithelial cells,GTEC)的黏附力强弱,将不同Mo菌株以109 CCU/mL浓度,0.2 mL/只,接种到7日龄SPF鸡胚的卵黄囊中,设阴性对照组和空白对照组,检测并观察Mo感染鸡胚致死率以及死亡鸡胚病理变化,记录鸡胚死亡时间,取死亡鸡胚的尿囊液进行PCR鉴定,同时对各个感染组的卵黄囊液进行PCR检测。结果显示,6株Mo均能黏附GTEC细胞,其中XJ15黏附力最强,XJN黏附力最弱。在鸡胚感染试验中,6株Mo均能引起鸡胚死亡,且不同Mo感染组鸡胚死亡数差异显著(P<0.05)。其中,XJ15感染组致死率为90%,1412和XJN感染组致死率为20%。感染组死亡鸡胚表面有出血,充血症状,尿囊液PCR检测均为阳性。表明,筛选出XJ15为致病性较强的Mo分离株,为后期Mo人工感染模型的建立奠定基础。

一例多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌及肺炎支原体混合感染绵羊的诊断

【目的】2022年7月新疆某地区羊场600只2月龄羔羊,其中100只出现反应迟钝、食欲下降、腹泻、体温高达40℃、死亡羔羊高达60只,部分出现不同程度的气喘、流鼻液和呼吸障碍,为了诊断该羊场出现的疾病。【方法】通过观察患病羊群的临床发病情况、对病死羊群的解剖检查、流行病学研究以及实验室检查。【结果】根据临床症状和解剖特征初步判断为肺炎,细菌检测为杆状革兰氏阴性菌,PCR检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌为阳性、绵羊肺炎支原体检测为阳性。【结论】确定了新疆某地区羊场的呼吸道病变是由多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌及绵羊肺炎支原体的混合感染造成的。

中国美利奴羊不同MBL型个体感染绵羊肺炎支原体的免疫应答分析

为探讨中国美利奴羊不同甘露(聚)糖结合凝集素(MBL)型个体感染绵羊肺炎支原体的免疫应答变化,对4种不同MBL型个体进行MBL水平测定,选择其中20只作为对照组,50只为试验组,在相同饲养条件下试验组人工感染绵羊肺炎支原体,分别在攻毒前1d(-1d)、攻毒后1d(1d)、1周(7d)、2周(14d)、3周(21d)用ELISA方法定量分析血清中TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3水平。结果显示,A型和B型其MBL浓度较低,C型MBL浓度较高,与对照组相比,在攻毒后1周,A型和B型IFN-γ表达显著降低(P<0.05),攻毒后2周,补体C3表达显著降低,TNF-α升高显著(P<0.05);与A型和B型相比,在攻毒后1周,C型IFN-γ表达增加(P<0.05),在攻毒后2周,补体C3表达增加、TNF-α显著降低(P<0.05),补体C1各组均不显著。结论:低血清MBL浓度与绵羊支原体肺炎有一定的相关性,不同基因型之间其TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3水平有差异,低浓度MBL绵羊更易发生比较严重的炎症反应。