PLCγ1对绵羊早期胚胎超微结构的影响

为了探究绵羊磷脂酶Cγ1(PLCγ1)基因对绵羊早期胚胎发育的影响,从微观角度解释胚胎的内部发育规律。卵母细胞分离培养至成熟,显微注射同等浓度的pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1重组质粒后随机分成两组,PLCγ1处理组在注射后培养24 h、48 h;U73122处理组在显微注射后12 h向培养液中添加最优抑制PLCγ1的U73122浓度0.5μmol/L,两组分别在24 h、48 h固定胚胎做超薄切片,电镜观察透明带、脂滴、线粒体及胚胎发育情况。结果表明,显微注射重组质粒后能够促进胚胎发育,并且随着胚胎的发育,透明带呈不规则性疏松,PLCγ1处理组与U73122处理组的不同时间段以及相同时间段之间,透明带厚度均存在极显著差异(P<0.01)。线粒体在胞质内呈均匀分布,PLCγ1处理组线粒体横脊少且形状规则,成熟的线粒体含量较多;U73122处理组线粒体嵴深且长,出现空泡化异常形态,线粒体异常率(31.72%±3.316%)极显著高于PLCγ1处理组(22.01%±6.652%)。脂滴随机分布于各卵裂球中,U73122处理组脂滴形态出现异常,数量多于PLCγ1处理组。以上结果初步证明,绵羊早期胚胎发育过程中,PLCγ1基因可通过影响透明带厚度、线粒体及脂滴等改变细胞代谢水平从而调整胚胎发育。

间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊早期胚胎中的表达

为了研究间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊胚胎早期发育过程各阶段的表达情况,利用RT-PCR扩增得到绵羊Cx43(43 ku)及Cx45(45 ku)基因的mRNA,并进行序列测定。收集绵羊未成熟和成熟卵母细胞以及体外受精早期胚胎各发育阶段的卵裂球细胞,通过RT-PCR半定量检测Cx43和Cx45基因的mRNA表达量;通过免疫组织化学方法结合激光扫描共聚焦显微镜检测Cx43和Cx45蛋白在绵羊体外受精的早期胚胎发育过程中的表达情况及表达区域。结果表明,在绵羊卵母细胞成熟过程以及早期胚胎发育的各个时期,Cx43及Cx45在mRNA水平和蛋白水平均有表达;Cx43、Cx45蛋白主要分布在细胞膜表面,在细胞质和细胞核中表达微弱。研究结果为进一步探索Cx43和Cx45在绵羊早期胚胎发育过程中的作用提供了试验数据。

胰岛素样生长因子及其受体在绵羊早期胚胎的表达

旨在研究IGF s及其受体(IGFR)在绵羊卵母细胞和早期胚胎中的表达.对绵羊进行超数排卵处理,手术法采卵得到卵母细胞和着床前早期胚胎,结合荧光免疫染色方法和激光共聚焦成像系统,研究了绵羊未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞和着床前各期胚胎中IGF-I、IGF-II、IGF-IR、IGF-IIR的表达情况.结果表明,IGF-I、IGF-II在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞中均有表达;受精后,直到囊胚的整个早期发育阶段也检测到了这两个因子的表达,且胚胎免疫染色在各卵裂球之间呈现不均匀的分布.IGF-IR和IGF-IIR在未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞和早期胚胎均有表达,在胚胎期主要分布于卵裂球细胞的顶端(ap ica l surface),而在囊胚阶段主要在滋胚层细胞中表达,内细胞团没有表达.

超微量DNA模板扩增鉴定绵羊早期胚胎性别体系优化

本实验旨在运用超微量胚胎DNA模板扩增SRY基因鉴定绵羊早期胚胎性别PCR体系和方法优化。根据绵羊Y染色体性别决定SRY基因的723 bp的保守序列设计引物,析因法建立巢式PCR体系,联合扩增SRY和GAPDH基因,经绵羊静脉血液和胚胎超微量DNA样本调整测试灵敏度后,切割40枚绵羊桑椹胚的少量胚细胞进行性别鉴定,并对PCR产物进行测序对比。结果显示:通过2%的琼脂糖电泳检测,除363 bp的GAPDH基因扩增条带公母羊皆出现外,只有公羊出现209 bp的雄性特异扩增条带。本实验建立的绵羊早期胚胎性别鉴定方法体系灵敏度可以达到约10 pg(3~4个细胞),对胚胎进行性别鉴定的准确率为100%。