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枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响 被引量:1
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作者 齐盟 辛雅明 +2 位作者 白绥明 胡亮 杨银凤 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第11期52-58,共7页
为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检... 为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间;再使用不同浓度的肽聚糖(0、10、20、30、40和50μg/mL)刺激ORECs 2 h,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激浓度。结果显示:(1)使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着时间的增加呈先下降后升高的趋势,2 h时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(2)使用不同浓度肽聚糖刺激ORECs 2 h时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着肽聚糖浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在20μg/mL时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(3)不同时间刺激试验和不同浓度刺激试验均不会对ORECs产生细胞毒性作用。结果表明,来源于枯草芽孢杆菌的肽聚糖能够诱导ORECs表达SBD-1,最佳刺激条件为20μg/mL枯草芽孢杆菌肽聚糖刺激ORECs 2 h。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌肽聚糖 绵羊瘤胃上皮细胞(orecs) β-防御素-1(SBD-1) 荧光定量PCR(qPCR) 酶联免疫吸附试验(ELISA) CCK8
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枯草芽孢杆菌细胞壁通过TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信号通路调控绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1的表达
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作者 辛雅明 白绥明 +9 位作者 白刚 高景鹏 樊翀宇 韩彩霞 周伟 张文彦 永荣 齐盟 肖红 杨银凤 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第10期1-8,共8页
为了探索枯草芽孢杆菌细胞壁诱导绵羊β-防御素-1(SBD-1)表达的主要信号转导途径,本试验首先使用反复冻融法与超声波破碎法相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并收集其细胞壁,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法分析细胞壁成分及其含量,然后利... 为了探索枯草芽孢杆菌细胞壁诱导绵羊β-防御素-1(SBD-1)表达的主要信号转导途径,本试验首先使用反复冻融法与超声波破碎法相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并收集其细胞壁,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法分析细胞壁成分及其含量,然后利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)方法检测枯草芽孢杆菌细胞壁刺激绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)后通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2)mRNA和蛋白的表达变化,最后使用通路抑制剂分别阻断NF-κB、p38、JNK和ERK1/2信号通路,用枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs并检测刺激后SBD-1 mRNA表达变化,从而确定诱导SBD-1表达的主要信号通路。结果显示,枯草芽孢杆菌细胞壁制备成功,细胞壁主要成分为肽聚糖和磷壁酸,含量分别为(90.85±0.91)%和(8.85±0.11)%。与对照组相比,枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs后信号通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2)的mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),使用通路抑制剂阻断各个信号通路后再刺激ORECs,SBD-1 mRNA表达水平均极显著下降(P<0.01),且添加NF-κB和JNK抑制剂组下降幅度最大。结果表明,枯草芽孢杆菌细胞壁可能通过TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信号通路调控ORECs SBD-1的表达。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌细胞 绵羊瘤胃上皮细胞 β-防御素-1 抑制剂 信号通路
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枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响
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作者 白绥明 辛雅明 +2 位作者 齐盟 胡亮 杨银凤 《畜牧与饲料科学》 2023年第5期8-14,共7页
[目的]探究枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。[方法]采用Cell Counting kit-8(CCK-8)方法筛选对ORECs无明显毒性作用的枯草芽... [目的]探究枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。[方法]采用Cell Counting kit-8(CCK-8)方法筛选对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌培养上清液刺激浓度范围与刺激时间范围。用筛选出的无明显毒性作用的不同浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs 8 h后,采用荧光定量PCR(qPCR)技术和酶联免疫吸附(ELISA)检测方法筛选枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。[结果]①对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌对应的培养上清液浓度范围为10^(7)~10^(11) CFU/mL,刺激时间范围为2~24 h。②利用qPCR技术和ELISA检测方法筛选出最佳刺激浓度为10^(11) CFU/mL枯草芽孢杆菌对应的培养上清液。③以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间为24 h。[结论]枯草芽孢杆菌培养上清液可以诱导ORECs SBD-1的表达。 展开更多
关键词 绵羊瘤胃上皮细胞 枯草芽孢杆菌培养上清液 β-防御素-1 荧光定量PCR
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酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)基因表达的影响 被引量:12
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作者 金鑫 张曼 +2 位作者 范燕茹 王佩 杨银凤 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第19期3910-3918,共9页
【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的调节作用,为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新鲜的绵羊瘤胃组织用PBS和抗生素处... 【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的调节作用,为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新鲜的绵羊瘤胃组织用PBS和抗生素处理后进行瘤胃上皮细胞原代培养,当原代细胞数量长到细胞培养瓶的85%以上时,将细胞传于12孔板用于细胞刺激试验。同时将活化并纯化后的酿酒酵母菌25℃、180 r/min有氧培养48 h后,进行5次平行平板计数试验,根据平板计数的数据处理方法,得到浓度为5.2×108CFU·m L-1的酿酒酵母菌液,再通过倍比稀释把所得菌液依次稀释成浓度为5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU·m L-1的菌液,用以上不同浓度(5.2×104—5.2×108CFU·m L-1)的酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞分别进行不同时间(2、4、8、12、24 h)的刺激,并设置对照组用DMEM/F12培养基代替酿酒酵母菌。然后提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测瘤胃上皮细胞中SBD-1表达差异。最后用SAS 9.2软件对数据进行相关差异性分析。【结果】荧光定量PCR结果表明,在各时间组内SBD-1 m RNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1时表达量达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P<0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 m RNA的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势,刺激时间为12 h时SBD-1 m RNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU·m L-1的菌液刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P<0.01)。ELISA检测结果显示,SBD-1蛋白表达趋势与SBD-1 m RNA检测结果基本一致。不同浓度的菌液分别刺激绵羊瘤胃上皮细胞2、4、8、12、24 h后均能提高共培养上清中SBD-1蛋白的表达,且与对照组相比存在极显著差异(P<0.01)。在菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高,与此浓度下各时间组相比差异极显著(P<0.01)。【结论】酿酒酵母菌能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1的表达量达到最高。 展开更多
关键词 β-防御素-1 瘤胃上皮细胞 酿酒酵母菌 实时荧光定量PCR 酶联免疫吸附测定 绵羊
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酿酒酵母甘露聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(S BD-1)表达的影响 被引量:5
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作者 金鑫 张曼 +3 位作者 王云鹤 魏方 温婧怡 杨银凤 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1117-1121,共5页
为探究酿酒酵母菌细胞壁成分甘露聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(RECs)β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本研究用不同浓度的甘露聚糖刺激RECs 8 h后,利用荧光定量PCR (qPCR)和ELISA方法分别检测RECsSBD-1 mRNA的转录水平和蛋白表达变化,确定甘露... 为探究酿酒酵母菌细胞壁成分甘露聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(RECs)β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本研究用不同浓度的甘露聚糖刺激RECs 8 h后,利用荧光定量PCR (qPCR)和ELISA方法分别检测RECsSBD-1 mRNA的转录水平和蛋白表达变化,确定甘露聚糖诱导SBD-1表达量最高的刺激浓度。然后用该浓度甘露聚糖对RECs进行不同时间的刺激,同样利用qPCR和ELISA方法对SBD-1 mRNA转录水平和蛋白的表达变化进行检测,确定甘露聚糖诱导SBD-1表达的最佳时间。qPCR和ELISA结果显示:不同浓度甘露聚糖刺激RECs8 h后,SBD-1 mRNA转录水平和蛋白的表达量均有所增加,但随着甘露聚糖浓度的增加,SBD-1表达量呈现先升高后降低的趋势,且当甘露聚糖浓度为50μg/mL时SBD-1表达量达到最大,并与对照组相比差异极显著(p<0.01)。当用50μg/mL的甘露聚糖分别刺激RECs不同时间后,SBD-1 mRNA转录水平和蛋白的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势,刺激时间为4 h时SBD-1表达量达到峰值,且极显著高于对照组(p<0.01),之后呈下降趋势。结果表明甘露聚糖能够提高绵羊RECs SBD-1的表达,且甘露聚糖浓度为50μg/mL刺激RECs 4h时,SBD-1 mRNA转录水平和蛋白表达量达到最高。本研究为甘露聚糖在体内如何发挥先天性免疫提供了一种新解释,也为更好的开发利用甘露聚糖制剂提供实践指导。 展开更多
关键词 甘露聚糖 绵羊瘤胃上皮细胞 β-防御素-1 荧光定量PCR ELISA
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酿酒酵母β-葡聚糖通过膜受体Dectin-1和TLR-2诱导绵羊瘤胃上皮细胞表达SBD-1的机制研究 被引量:2
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作者 张曼 金鑫 +3 位作者 王云鹤 魏方 温婧怡 杨银凤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期781-790,共10页
为了探索酿酒酵母β-葡聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达过程中膜受体Dectin-1和TLR-2可能存在的作用。本研究首先利用免疫组化、RT-PCR、免疫荧光和Western ... 为了探索酿酒酵母β-葡聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达过程中膜受体Dectin-1和TLR-2可能存在的作用。本研究首先利用免疫组化、RT-PCR、免疫荧光和Western blot等方法检测Dectin-1是否在ORECs内表达,并且采用qPCR和Western blot方法对β-葡聚糖刺激ORECs后细胞膜受体Dectin-1和TLR-2的表达变化进行检测。而后用不同浓度的Dectin-1阻断剂昆布多糖或TLR-2特异性封闭抗体分别预处理ORECs后,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的表达变化,以确定β-葡聚糖诱导SBD-1表达过程中Dectin-1和TLR-2的参与情况。结果显示:1)绵羊瘤胃组织及ORECs内存在Dectin-1表达,且β-葡聚糖刺激ORECs后Dectin-1和TLR-2的表达水平显著增加(P<0.05);2)不同浓度的昆布多糖和TLR-2封闭抗体均可以极显著降低β-葡聚糖诱导SBD-1的表达(P<0.01),且随着阻断剂和封闭抗体浓度的增加,其抑制SBD-1表达的作用越明显。结果表明,Dectin-1在绵羊瘤胃组织及ORECs内均表达,并且酿酒酵母β-葡聚糖在ORECs中诱导SBD-1的表达是由Dectin-1和TLR-2介导产生的。 展开更多
关键词 Β-葡聚糖 SBD-1 绵羊瘤胃上皮细胞 DECTIN-1 TLR-2
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脾酪氨酸激酶参与酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)的表达 被引量:1
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作者 金鑫 张曼 杨银凤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1082-1090,共9页
为了探索脾酪氨酸激酶(Syk)是否参与酿酒酵母甘露聚糖(S.c M)诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)β-防御素-1(SBD-1)表达的过程,首先利用免疫组化、RT-PCR和免疫荧光等方法检测Syk在ORECs内的表达情况;然后采用qPCR和Western blot方法检测S.c ... 为了探索脾酪氨酸激酶(Syk)是否参与酿酒酵母甘露聚糖(S.c M)诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)β-防御素-1(SBD-1)表达的过程,首先利用免疫组化、RT-PCR和免疫荧光等方法检测Syk在ORECs内的表达情况;然后采用qPCR和Western blot方法检测S.c M刺激ORECs后Syk的表达变化,同时用Western blot方法检测Syk的磷酸化水平;接着用3条Syk特异性siRNAs(#1、#2和#3)转染ORECs 24 h后,qPCR检测Syk mRNA的表达变化,筛选出干扰效果最佳的Syk siRNA;最后用效果最佳的siRNA和Syk特异性抑制剂R406分别处理ORECs后,采用qPCR和ELISA检测SBD-1的表达变化,以确定Syk在S.c M诱导SBD-1表达过程中的作用。结果显示:Syk在ORECs内表达;且S.c M刺激ORECs后Syk的mRNA和蛋白表达水平显著高于未刺激组(P<0.01或P<0.05),S.c M刺激ORECs不同时间(5、15、30、45和60 min)均能使Syk发生磷酸化,且刺激15 min后磷酸化水平达到最大(P<0.01);此外,Syk的3条特异性siRNAs转染ORECs后Syk的表达均降低,且Syk siRNA#2的抑制效果最明显(P<0.01);同时Syk siRNA#2和R406均能极显著降低S.c M诱导ORECs SBD-1的表达(P<0.01)。上述结果表明,Syk参与S.c M诱导ORECs SBD-1的表达。 展开更多
关键词 酿酒酵母甘露聚糖 绵羊β-防御素-1 瘤胃上皮细胞 SYK
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枯草芽孢杆菌细胞壁对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响 被引量:2
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作者 辛雅明 赵霏霏 +1 位作者 杨丹 杨银凤 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第2期57-63,共7页
为探究枯草芽孢杆菌细胞壁能否对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells, ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)的表达产生影响,先利用反复冻融和超声波破碎相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并成功收集其细胞壁,... 为探究枯草芽孢杆菌细胞壁能否对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells, ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)的表达产生影响,先利用反复冻融和超声波破碎相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并成功收集其细胞壁,将不同浓度(0、25、50、100、200、400μg·mL^(-1))的枯草芽孢杆菌细胞壁与ORECs共培养8 h后,采用荧光定量PCR和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法筛选出枯草芽孢杆菌细胞壁诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,最后用该浓度条件下的枯草芽孢杆菌细胞壁对瘤胃上皮细胞进行不同时间(2、4、8、12、24 h)的刺激,采用荧光定量PCR和ELISA方法筛选出枯草芽孢杆菌细胞壁诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。结果显示:枯草芽孢杆菌细胞壁成功制备,不同浓度(0、25、50、100、200、400μg·mL^(-1))的枯草芽孢杆菌细胞壁对ORECs均无毒性作用,并能极显著促进ORECs中SBD-1 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),以浓度为50μg·mL^(-1)的枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs 12 h时SBD-1 mRNA和蛋白的表达量达到最大且与对照组呈极显著差异(P<0.001)。研究表明,枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度为50μg·mL^(-1),最佳刺激时间为12 h。本研究为枯草芽孢杆菌细胞壁诱导调节SBD-1机制的研究提供理论依据。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌细胞 绵羊瘤胃上皮细胞(orecs) β-防御素-1 荧光定量PCR
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灭活枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响 被引量:3
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作者 赵霏霏 辛雅明 +1 位作者 杨丹 杨银凤 《动物医学进展》 北大核心 2021年第6期56-62,共7页
以体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞(ovine rumen epithelial cells,ORECs)为试验模型,旨在探究灭活枯草芽孢杆菌对ORECs绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。首先用不同浓度的灭活枯草芽孢杆菌(10^(7)、10^(8)、10^(9)、10... 以体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞(ovine rumen epithelial cells,ORECs)为试验模型,旨在探究灭活枯草芽孢杆菌对ORECs绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。首先用不同浓度的灭活枯草芽孢杆菌(10^(7)、10^(8)、10^(9)、10^(10)、10^(11)CFU/mL)诱导ORECs 8 h,通过荧光定量PCR(qPCR)和ELISA的方法检测ORECs SBD-1表达量在mRNA水平和蛋白水平的变化,确定灭活枯草芽孢杆菌诱导ORECs SBD-1表达最高的菌液浓度为最佳刺激浓度。以该浓度的灭活枯草芽孢杆菌诱导ORECS不同时间(2 h、4 h、8 h、12 h),通过qPCR和ELISA的方法检测ORECs SBD-1表达量在mRNA水平和蛋白水平的变化,从而筛选出诱导SBD-1表达的最佳时间。结果表明,10^(8)~10^(11)CFU/mL的灭活枯草芽孢杆菌可以显著的促进ORECs SBD-1的表达,其中灭活枯草芽孢杆菌的浓度为10^(10)CFU/mL时诱导ORECs 8h时SBD-1 mRNA表达量最高,与对照组相比差异极显著(P<0.01);SBD-1蛋白表达量以10^(10)CFU/mL灭活枯草芽孢杆菌诱导ORECs 12 h时达到最大,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。结果证明了热灭活后的枯草芽孢杆菌仍可以诱导SBD-1表达,其诱导SBD-1表达的有效成分并未被热灭活,为后续确定枯草芽孢杆菌诱导SBD-1表达的有效成分的研究提供了理论基础。 展开更多
关键词 绵羊瘤胃上皮细胞 枯草芽孢杆菌 β-防御素-1 荧光定量PCR
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酿酒酵母细胞壁诱导体外培养绵羊瘤胃上皮细胞表达SBD-1的研究 被引量:5
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作者 田巧珍 金鑫 +3 位作者 张曼 张召议 王云鹤 杨银凤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期927-934,共8页
旨在探究酿酒酵母细胞壁对原代培养绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的影响。本试验首先提取酿酒酵母细胞壁,并进行鉴定;再用酿酒酵母细胞壁(0、25、50、100、200、400μg·mL^(-1))刺激健康绵羊的原... 旨在探究酿酒酵母细胞壁对原代培养绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的影响。本试验首先提取酿酒酵母细胞壁,并进行鉴定;再用酿酒酵母细胞壁(0、25、50、100、200、400μg·mL^(-1))刺激健康绵羊的原代瘤胃上皮细胞(0、2、4、8、12、24h)后,进行RT-qPCR和ELISA试验,确定诱导SBD-1表达的最佳浓度和时间。结果表明:1)本试验提取的酿酒酵母细胞壁成分较纯,可用于后续试验;2)体外培养绵羊瘤胃上皮细胞呈鹅卵石铺路状,符合试验要求;3)使用200μg·mL^(-1)的酿酒酵母细胞壁去刺激瘤胃上皮细胞12h,SBD-1mRNA和蛋白表达量最大,与其他组相比均差异极显著(P<0.001)。综上表明,酿酒酵母细胞壁能够促进绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且酵母细胞壁最佳浓度和刺激时间分别为200μg·mL^(-1)和12h。 展开更多
关键词 酿酒酵母 细胞 绵羊 瘤胃上皮细胞 β-防御素-1
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绵羊瘤胃上皮细胞的体外分离培养、冻存及复苏方法 被引量:5
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作者 金鑫 张曼 +3 位作者 王云鹤 魏方 温婧怡 杨银凤 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期57-66,共10页
本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃... 本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。 展开更多
关键词 绵羊 瘤胃上皮细胞 原代培养 传代培养 冻存 复苏
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酿酒酵母培养物和提取物对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响 被引量:4
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作者 魏方 赵霏霏 杨银凤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1616-1623,共8页
建立绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)培养体系为体外试验模型,旨在探索酿酒酵母培养物和提取物对ORECs中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达效果的影响。首先,分别用200 mg/L酿酒酵母培养物和提取... 建立绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)培养体系为体外试验模型,旨在探索酿酒酵母培养物和提取物对ORECs中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达效果的影响。首先,分别用200 mg/L酿酒酵母培养物和提取物诱导ORECs不同时间段(0,6,12,18,24,30 h)后,经qPCR扩增反应检测SBD-1 mRNA表达量,以分别确定酿酒酵母培养物和提取物诱导SBD-1 mRNA表达最高的刺激时间;然后用不同质量浓度梯度(0,100,200,300,400 mg/L)酿酒酵母培养物和提取物分别诱导ORECs最佳时间段后,同样地采用qPCR扩增技术检测SBD-1 mRNA表达量,从而筛选出诱导SBD-1 mRNA表达最高的酿酒酵母培养物浓度和酿酒酵母提取物浓度。结果显示,酿酒酵母培养物和提取物均可诱导SBD-1 mRNA表达。当酿酒酵母培养物质量浓度为400 mg/L、酿酒酵母提取物质量浓度为200 mg/L分别刺激ORECs 6 h时,ORECs SBD-1 mRNA表达量分别达到最高,且均极显著高于对照组(P<0.01)。最后在相同试验条件下,分别使用最佳诱导质量浓度的酿酒酵母培养物(即400 mg/L)和酿酒酵母提取物(即200 mg/L)诱导ORECs最佳时间(即6 h),比较两者诱导ORECs SBD-1 mRNA表达效果,qPCR结果显示酿酒酵母提取物诱导SBD-1 mRNA表达显著高于酿酒酵母培养物(P<0.05)。结果表明,酿酒酵母培养物和提取物均能够诱导ORECs SBD-1表达,400 mg/L酿酒酵母培养物和200 mg/L酿酒酵母提取物分别刺激ORECs 6 h后SBD-1表达量最高,且酿酒酵母提取物诱导效果优于酿酒酵母培养物。 展开更多
关键词 绵羊瘤胃上皮细胞(orecs) 酿酒酵母培养物 酿酒酵母提取物 β-防御素-1 qPCR
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酿酒酵母菌诱导SBD-1 mRNA表达的研究
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作者 金鑫 张曼 +3 位作者 田巧珍 刘骄 王云鹤 杨银凤 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2017年第7期10-12,15,共4页
为了探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1,SBD-1)表达的调节作用。建立绵羊瘤胃上皮细胞培养体系作为体外试验模型,用不同浓度酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞刺激2 h后分别进行不同时间... 为了探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1,SBD-1)表达的调节作用。建立绵羊瘤胃上皮细胞培养体系作为体外试验模型,用不同浓度酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞刺激2 h后分别进行不同时间的诱导培养,然后利用实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)研究接受刺激后瘤胃上皮细胞中SBD-1 mRNA表达的差异。结果表明,在各时间组内,SBD-1 mRNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU/m L时表达量均达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P﹤0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 mRNA的表达量先是随着诱导培养时间的延长而呈上升趋势,诱导培养时间为12 h时SBD-1 mRNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU/m L的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P﹤0.01)。本试验结果表明,酿酒酵母菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且浓度为5.2×107CFU/m L的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时,SBD-1的表达量达到最高。 展开更多
关键词 β-防御素-1 瘤胃上皮细胞 酿酒酵母菌 实时荧光定量PCR 绵羊
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Dectin-2和TLR-2在酿酒酵母甘露聚糖诱导SBD-1表达过程中的作用
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作者 金鑫 张曼 +3 位作者 王云鹤 魏方 温婧怡 杨银凤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期122-128,共7页
为了探索膜受体Dectin-2和TLR-2在酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达过程中的作用。本研究首先利用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法确定Decti... 为了探索膜受体Dectin-2和TLR-2在酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达过程中的作用。本研究首先利用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法确定Dectin-2是否在ORECs内表达;然后采用qPCR和Western blot方法检测甘露聚糖刺激ORECs后Dectin-2和TLR-2的表达变化;最后用qPCR和ELISA方法检测不同质量浓度(0.1,1.0,10.0 mg/L)的Dectin-2和TLR-2特异性封闭抗体对甘露聚糖诱导SBD-1表达的影响。结果显示:ORECs内表达Dectin-2,且甘露聚糖刺激ORECs后Dectin-2和TLR-2的表达量均显著增加(P<0.01);同时甘露聚糖可以诱导SBD-1的表达(P<0.01),但是该表达过程可以被不同质量浓度的Dectin-2封闭抗体和TLR-2封闭抗体所抑制(P<0.05),且随着抗体浓度的增加,这种抑制作用越明显。此外,在封闭抗体质量浓度相同时,Dectin-2封闭抗体比TLR-2封闭抗体抑制SBD-1表达的作用更明显(P<0.05)。结果表明,酿酒酵母甘露聚糖诱导SBD-1的表达与Dectin-2和TLR-2受体有关,但是Dectin-2在此过程中发挥更主要的作用。 展开更多
关键词 甘露聚糖 β-防御素-1 绵羊瘤胃上皮细胞 Dectin-2 TLR-2
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