基于转录组学分析自然感染绵羊肺腺瘤病毒患羊肺肿瘤组织中转录差异基因及病毒致瘤机制的研究

绵羊肺腺瘤病(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的绵羊传染性肺肿瘤疾病。为探究JSRV对绵羊肺脏的致瘤机制,本研究从自然感染JSRV的羊(OPA患羊)肺肿瘤组织和健康羊肺组织中提取总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina Hi Seq 4000高通量测序平台进行转录组学测序(RNA-Seq),采用DESeqR筛选健康绵羊与患病绵羊肺组织中的转录差异基因,并以P<0.05和log2(Fold change)≥1筛选转录显著差异基因。通过GO和KEGG数据库对转录显著差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析,并采用RT-qPCR对随机选择的10个转录显著差异基因进行验证。结果显示,与对照组相比,OPA羊肺肿瘤组织中共筛选到1 360个转录上调基因和783个转录下调基因,其中154个转录显著上调基因,212个转录显著下调基因。GO功能分析显示,转录显著差异基因显著富集在178个GO条目中,包括114个生物过程(BP)、19个细胞成分(CC)和45个分子功能(MF),主要涉及生长因子活性、复制后修复、NAD^(+)二磷酸酶活性、核苷代谢过程和鸟苷核苷酸交换因子活性等生物学功能。KEGG分析显示转录显著差异基因主要富集在细胞增殖、分化和肿瘤生成,如PI3K/Akt、MAPK和Hippo等信号通路。RT-qPCR结果显示,10个转录显著差异基因与RNA-Seq筛选结果均一致。本研究进一步通过RT-qPCR、western blot检测Hippo信号通路核心蛋白哺乳动物STE20样蛋白激酶1/2 (MST1/2)、大肿瘤抑制因子1/2 (LATS1/2)、YES相关蛋白1/2 (YAP1)在两组绵羊肺组织样品中的转录及表达水平和YAP1的磷酸化水平(p-YAP1);采用免疫组化试验(IHC)检测Hippo信号通路中上述核心蛋白在两组绵羊肺组织中的表达及定位。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,OPA羊肺组织中MST1和YAP1 mRNA的转录水平均极显著上调(P<0.01、P<0.001),LATS1 mRNA的转录水平显著上调(P<0.05)。Western blot结果显示,MST1/2蛋白在59 ku、YAP1和p-YAP1蛋白在65 ku、LATS1/2蛋白在140 ku处分别出现特异性条带;与对照组相比,OPA绵羊肺肿瘤组织中MST1/2和p-YAP1的表达水平显著上调(P<0.05),LATS1/2和YAP1的表达水平极显著上调(P<0.01)。IHC结果显示,在OPA组和对照组羊肺组织中MST1/2、LATS1/2及p-YAP1均定位于肺组织细胞质中,且与对照组相比,OPA组羊肺组织中上述分子均呈强阳性表达。YAP1主要定位于对照组羊肺组织细胞的胞质中,而在OPA组中YAP1主要定位于细胞核中(少量定位于细胞质中)。上述结果表明,OPA组绵羊肺组织中存在转录显著差异基因,主要参与细胞增殖、肿瘤发生和转移等过程,且主要富集在PI3K/Akt、MAPK、Hippo等信号通路,尤其是Hippo信号通路中的YAP蛋白可能通过核异位促进肿瘤的发生与发展。本研究为JSRV致瘤机制提供了新的研究基础与研究思路和方向。

绵羊肺腺瘤病综述

绵羊肺腺瘤病(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的以肺脏肿瘤为主要特征的慢性消耗性疾病。临床上以呼吸道内积聚大量渗出液为主要特征,剖检可见肺脏肿大、不回缩。本文对OPA的病原学、流行病学、临床症状、剖检变化及诊断技术进行综述,以期为研究该病提供参考。

绵羊肺腺瘤分子病原学研究进展

绵羊肺腺瘤病是一种由病毒引起的,发病部位仅在肺脏的肿瘤性疾病。这种病的潜伏期往往很长,初期发病时常被误认为是肺部的细菌常规感染,从而造成误诊。由于目前还没有可用于治疗的药物,羊群一旦感染往往很难净化,由此,大量科技工作者对该病进行了深入研究。该文就绵羊肺腺瘤分子病原学研究进展进行综述,以期为相关从业者提供参考。

内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒的研究进展

从内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(enJSRV)与外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(exJSRV)基因组结构的比较、enJSRV与绵羊肺腺瘤病(OPA)的关系、enJSRV在羊体内的表达及其系统发育分析等方面综述了enJSRV的研究进展,旨在为早期诊断及预防OPA提出新方法,为揭示该病的分子发病机理及探索其基因治疗提供新思路。

绵羊肺腺瘤病毒致瘤机制研究进展

绵羊肺腺瘤(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)引起的一种慢性、传染性绵羊肺脏肿瘤性疾病,该病对养羊业,特别是种羊的发展有重大影响,世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病。论文就近年来国内外关于OPAV致瘤机制的相关研究进行了综述,包括OPAV的转录特异性和囊膜蛋白的致瘤作用和OPAV受体等。这对深入研究OPAV的致瘤机制及确定相应的防控靶点,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

绵羊肺腺瘤病毒中国NM株部分gag基因的克隆与序列分析

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因序列,设计合成一对引物,对绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙株的gag基因中主要编码CA蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约897bp的特异条带,将其回收后克隆入pMD-18 T载体中,并进行序列测定与分析。结果表明,与南非株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为83%,推导出的氨基酸同源性为84%。与美国株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为81.5%,氨基酸同源性为83%。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。

外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活Akt/mTOR信号通路及调控Beclin1的研究

为进一步探究外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)囊膜蛋白(Env)的致病机制,本研究检测了自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的绵羊肺组织中p-Akt和p-mTOR的表达定位、Akt和mTOR在肺组织中的磷酸化水平以及Beclin1在病肺组织中的表达水平,同时通过表达exJSRV-env的重组表达质粒诱导转化NIH3T3细胞,检测诱导转化的细胞中Akt和mTOR的磷酸化水平、Beclin1的表达水平。此外,在诱导转化的细胞中添加mTOR抑制剂Rapamycin后,检测其对Beclin1表达的影响。结果显示,p-Akt和p-m TOR主要表达于自然感染OPA病变肺组织的肺泡上皮细胞和肿瘤细胞中,与健康肺组织比较,在自然感染OPA病变肺组织中的二者磷酸化水平升高显著(p<0.05),而Beclin1在自然感染OPA病肺组织中的表达降低显著。p-mTOR在转染env的NIH3T3细胞中的磷酸化水平极显著高于对照组细胞(p<0.01),Beclin1在转染env的NIH3T3细胞中的表达量极显著低于正常的NIH3T3细胞(p<0.01)。而添加mTOR抑制剂Rapamycin后转染env的NIH3T3细胞与对照组细胞相比,Beclin1的表达水平显著上调(p<0.05)。结果表明,自然感染OPA的病肺组织和转染env的NIH3T3细胞的Akt/mTOR信号通路被激活,并通过该通路抑制自噬,提示exJSRV-env可能通过抑制病变细胞的自噬促进肿瘤的形成。本研究为进一步探索JSRV Env诱导转化细胞及与细胞自噬之间的关系的研究奠定了基础。

绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株囊膜蛋白基因在大肠杆菌中的分段表达

为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术分别扩增编码囊膜蛋白(env)基因的表面蛋白(surface protein,SU)和跨膜蛋白(transmembrane protein,TM)区域基因,通过T-A克隆的方法分别克隆入pGEM-TEasy载体中,然后利用设计的起始密码、终止密码以及相应酶切位点的引物,把env基因的SU区和TM区基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中,分别构建SU和TM的重组表达质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入大肠杆菌BL21 CodonPlus中并在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以稳定的包涵体形式高效表达,表达的SU和TM融合蛋白表观分子质量约为68 ku和46 ku,表达量分别占全菌蛋白的25%和30%,并且从包涵体分离纯化得到的表达蛋白具有较高纯度,是一种理想的免疫原。

绵羊肺腺瘤病病毒NM株衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病病毒内蒙(NM)株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术扩增编码gag基因衣壳蛋白(Capsid protein,CA)基因,构建CA蛋白的重组表达质粒pGEX-4T-1-CA,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入Ecoli BL21 CodonPlus中,在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以可溶性和包涵体形式高效表达,表达的CA融合蛋白表观分子量约为37 Ku,表达量占全菌蛋白的20%,利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原。本研究为下一步利用重组蛋白研制绵羊肺腺瘤病病毒NM株的单克隆抗体及诊断试制盒等奠定了基础。

绵羊肺腺瘤病的病理学及RT-PCR诊断

对呼和浩特市四子王旗某种羊场的疑似绵羊肺腺瘤病的4只病羊,通过临床诊断、病理组织学观察,PCR、RT-PCR和半巢式PCR技术对疑似病羊进行检测诊断。结果显示:(1)"小推车试验"时有鼻液流出;(2)剖检时可见肺肿大实变,切开肺脏时可见大量泡沫状液体从切面渗出;(3)病理组织学观察肺脏有大小不一的腺瘤灶,而且肺泡上皮细胞呈乳头状增生;(4)根据GenBank中登录的绵羊肺腺瘤病毒全序列(AF105220),设计合成3对特异性引物和3条巢式引物,经RT-PCR、PCR及半巢式PCR法扩增并测序,利用RT-PCR和PCR分别扩增出与预期大小一致的条带U3(175bp)、env(225bp)、gag(300bp),序列分析表明与引起该病的绵羊肺腺瘤病毒序列同源性较高,分别达97.2%、96.5%、94.4%。应用半巢式引物扩增片段分别为U3(133bp)、env(178bp)、gag(275bp)。经过以上方法确诊该羊场的疑似病例为绵阳肺腺瘤病。

绵羊肺腺瘤病毒检测方法的研究进展

绵羊肺腺瘤(OPA)是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的一种肿瘤性传染病,该病潜伏期长,经呼吸道传播,冬季圈养种羊发病率高,目前无治疗措施,病死率为100%。OPA的持续存在对种羊生产形成了潜在威胁并造成较大经济损失,严重危害养羊业健康发展。所以,对OPA的早期精确诊断是防制本病的前提,尤其是在出入境检验检疫过程中对进出口羊的JSRV检测尤为重要。随着分子生物学技术的不断发展,JSRV分子生物学检测方法也得到不断的创新和改进。作者就近年来针对检测JSRV的聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针杂交技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、环介导等温扩增技术(LAMP)等方法的研究概况作一综述,为寻找快速准确并适用于出入境检疫的JSRV检测方法和进一步发展研究新型JSRV检测方法提供参考。

绵羊肺腺瘤病毒的巢式RT-PCR技术检测

目的为能够更加准确、敏感的检测绵羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis SPA)。方法本试验通过外源性绵羊肺腺瘤病毒的囊膜基因env的TM区和长末端重复序列LTR的U3区分别设计特异性的内外侧引物,运用巢式RT-PCR的方法进行检测,同时与普通RT-PCR进行比较。结果测得的绵羊肺腺瘤病毒的env基因和U3区序列与Gen-Bank中发表的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列(AF105220)同源性分别为100%和98%。特异性试验结果表明本试验设计的env基因和LTR的U3区的内外侧引物不能从健康绵羊、小鼠、家兔的肺组织以及感染了SPA羊的肾、肝、脾的RNA中扩增出条带。敏感性试验结果表明,env基因和LTR的U3区的巢式RT-PCR诊断方法最低能检测出的标准模板RNA量分别为48 fg和48 pg,而普通的RT-PCR,env基因及LTR的U3区的最低检出量分别为0.48 ng和4.8 ng,得出巢式RT-PCR的敏感性高于普通RT-PCR,同时env基因的敏感性高于LTR的U3区的敏感性。结论以上试验说明巢式RT-PCR技术对于检测绵羊肺腺瘤病具有很高的敏感性和实用性。

人工感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙株羔羊的临床病理学研究

试验旨在探讨试验性感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙株(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV-NM)对羊的淋巴细胞亚群、淋巴细胞凋亡、血气指标的影响。用含JSRV-NM株的病毒悬液1 mL气管内接种1日龄羔羊,对人工感染羊进行了临床症状观察、血液学检查、病理生理学的系统病理学研究。在不同时段用流式细胞仪检测外周血中淋巴细胞及其亚群的动态变化及淋巴细胞凋亡情况。同时,对血液做血气分析和血清酶的检测。人工感染羔羊均出现了一些轻微的绵羊肺腺瘤病(sheep pul-monary adenomatosis,SPA)临床症状。SPA攻毒组感染JSRV-NM株后前60 d,外周血中CD4+、CD8+T细胞保持较高水平;到感染后90 d呈现下降趋势。对淋巴细胞凋亡检测的结果显示,在感染JSRV-NM株前60 d,凋亡细胞都保持较高水平;而感染第90天后,晚期细胞凋亡显著低于对照组。血气分析结果显示,阴离子隙(AnGap)、细胞外液碱剩余(BE(ecf))、氯离子浓度(Cl-)、氧分压p(O2)、实际碳酸氢根(HCO3act)、标准碳酸氢根(HCO3std)、二氧化碳总量(TCO2)、氧饱和度(O2SAT)、氧含量(O2CT)9项在不同时期与对照组存在显著差异。接毒羔羊尚未发生SPA的典型症状,但试验羔羊的病情已经出现,处于SPA疾病的早期表现;病羊在感染JSRV-NM病毒株后,在一定时期内,血液中CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的变化是SPA病羊在疾病过程中细胞免疫和淋巴细胞受损的重要表现之一;外周血淋巴细胞会呈现不同程度的凋亡,JSRV-NM株诱导机体免疫细胞凋亡是一种重要的临床表现;本试验结果初步证明,血气分析方法在临床诊断绵羊肺腺瘤病时有一定的参考价值。

内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株gag基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

提取内源性绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株(NM)总DNA,参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株gag基因序列设计1对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的gag基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中进行测序得到完整的gag基因序列,并用DNAStar软件进行序列分析,分析结果表明,与内源性南非代表毒株enJS56A1(AF153615)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为98.9%。推导出的氨基酸同源性为98.4%。与外源性美国代表株JSRV21(AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为89.6%,氨基酸同源性为94.8%。利用生物信息学软件对其蛋白结构进行预测,结果表明gag-enJSRV-NM为一结构松散的蛋白分子,这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的全序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定了基础。

兰州地区绵羊肺腺瘤病的诊断及病理学研究

通过临床、病理学及PCR诊断技术,对兰州某羊场疑似绵羊肺腺瘤病的4例病羊进行了检测诊断和病理学分析.结果表明:病羊表现为临诊咳嗽,呼吸困难."手推车试验"时,有大量稀薄鼻液从鼻腔流出.病理变化主要表现为肺表面散布在大小不等的灰白色结节,肺切面有大量泡沫状液体流出,Ⅱ型肺泡上皮细胞大量增生使肺泡呈不规则腺泡状,并有增生的突起突入肺泡腔;病变区附近肺泡腔中有大量巨噬细胞充塞;特异性PCR检测扩增出531bp的特异性片段,与已知绵羊肺腺瘤病特异性片段大小一致;4例病羊确诊为绵羊肺腺瘤病.

绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白及其TM亚基通过激活Akt诱导NIH 3T3细胞转化

为进一步研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白(Env)及其亚基诱导NIH 3T3细胞转化的分子机制,本研究利用JSRV Env及其亚基真核细胞表达质粒分别诱导转化NIH 3T3细胞和稳定表达JSRV受体绵羊Hyal-2的NIH 3T3-Hyal2-HA细胞,并检测转化后细胞的接触抑制特性、Akt的激活和肿瘤相关基因的突变。结果显示,在NIH 3T3细胞中,Env及其穿膜蛋白亚基(TM)均具有诱导细胞转化、激活Akt的能力;而在NIH 3T3-Hyal2-HA细胞中,仅TM具有这样的能力。在细胞转化的过程中,肿瘤相关基因kras、nras、egfr、p53和pik3ca均未发生突变。结果表明,在JSRV Env诱导NIH 3T3细胞转化并激活Akt的过程中,TM亚基可能起主要作用,并且还具有单独诱导NIH 3T3细胞转化的能力;绵羊Hyal-2具有抑制JSRV Env诱导NIH 3T3细胞转化的作用。JSRV Env及其亚基诱导NIH 3T3细胞转化的分子机制可能与肿瘤相关基因突变无关。

绵羊肺腺瘤病毒env基因致瘤机制

绵羊肺腺瘤病是由外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)感染引起的肺脏肿瘤性疾病,病毒囊膜基因(env)是引起细胞转化的主要因素。JSRV env蛋白通过与细胞受体结合激活多种信号转导系统,启动细胞内抑制细胞凋亡和刺激细胞增生从而引起细胞癌变。对env致瘤机制的研究一直是揭示JSRV致病机理研究领域中的热点。本文就对JSRV编码的env基因的致瘤机制及研究进展作综述。

稳定表达绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2蛋白细胞系的建立

为构建稳定表达绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的NIH 3T3细胞系,本研究采用RT-PCR方法从绵羊瘤胃组织总RNA中扩增Hyal-2的cDNA,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA-Hyal2-HA。将该重组质粒转染NIH 3T3细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达JSRV受体蛋白Hyal-2的NIH 3T3细胞系。qPCR、间接免疫荧光及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,Hyal2-HA在NIH 3T3细胞中仍然能够稳定表达,并且主要分布于细胞膜上。JSRV囊膜蛋白诱导细胞转化试验显示,该蛋白的瞬时表达可以导致NIH 3T3细胞出现转化聚积灶,但失去了对稳定表达绵羊Hyal-2蛋白NIH 3T3细胞系的诱导转化作用,其作用机制尚待阐明。该细胞系的建立为进一步研究JSRV与其受体的相互作用致瘤机制奠定了基础。

绵羊肺腺瘤病研究进展

绵羊肺腺瘤病 ( OPA)是由外源性的 D型和 B型绵羊肺腺瘤反转录病毒 ( JSRV)引起的肺脏肿瘤性疾病 ,该病毒主要在肺肿瘤上皮细胞内高水平表达 ,病毒基因组内 L TR的活化和病毒囊膜蛋白的表达是引起体外细胞转化癌变的主要因素 ,其致瘤的可能机制是通过激活磷酯酰肌醇 3 -激酶 ( PI-3 K)和蛋白酶 K( AKT)信号通路来启动细胞内抑制细胞凋亡和刺激细胞增生的信号转导系统 ,从而引起细胞增生癌变。该病与人的细支气管 -肺泡癌 ( BAC)极相似 ,通过对 OPA的研究 ,不仅为早期诊断及预防该病提出新方法 ,而且为揭示 BAC的分子发病机制及探索其基因治疗提供新思路。

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒基因组的克隆与全序列分析

本研究参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列,设计合成8对引物,从内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺肿瘤组织中提取总DNA为模板,对JSRV-NM株基因组分8段进行PCR扩增,产物分别为8个(531bp,888bp,949bp,944bp,1428bp,947bp,1836bp,538bp)基因片段,将其分别克隆入pMD-18T载体中进行双向测序并拼接序列,获得完整的JSRV-NM株前病毒基因组全序列。结果表明,JSRV-NM株前病毒基因组全长7430bp,有相互重叠的4个较长的开放阅读框(ORF),分别代表gag、pro、pol和env基因。与绵羊肺腺瘤病毒Ⅰ型即南非代表株(NC-001494)和绵羊肺腺瘤病毒Ⅱ型即美国代表株(AF105220)的核苷酸同源性比较分别为90.4%和90%,推导出的氨基酸同源性分别为90%和89.1%。分析JSRV-NM株基因组结构,发现在LTR的上游和下游都具有外源性exJSRV特有的ScaⅠ酶切位点,在gag基因编码的NC区发现有2个较典型的“胱氨酸—组氨酸序列”,可形成锌指结构。在env基因编码的TM区有特异性的“YXXM”基序。用地高辛标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段制成探针,原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的病肺组织中JSRV-NM的RNA及前病毒DNA,结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达,说明JSRV-NM株是具有致瘤作用的外源性反转录病毒。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列。