绵羊胚胎成纤维细胞的体外培养

用组织块法对绵羊胚胎成纤维细胞进行原代和传代培养,探讨绵羊胚胎成纤维细胞适宜的培养模式。成功获得较均一稳定的细胞群体,并成功地对细胞进行了冷冻保存和复苏。对于进行大规模的动物细胞培养具有重要的指导意义。

siRNA干扰绵羊胚胎成纤维细胞Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率

在动物细胞中，抑制非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）修复途径，可以提高同源重组（Homologous recombination, HR）修复基因组双链断裂（Double-strand brakes, DSBs）的发生概率。为了提高绵羊胚胎成纤维细胞的 HR 效率，针对 NHEJ 修复途径中的关键因子 Lig4（DNA ligase 4）基因，本文设计合成4个具有靶向性的 siRNA（Small interfering RNA）。绵羊胚胎成纤维细胞经电转染导入 siRNA，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和 Western blotting 检测，筛选出有效抑制 Lig4基因表达的2个 siRNA。应用质粒重连法检测HR 修复效率，将 I-SceⅠ酶线性化的 HR 质粒和 siRNA 共转染绵羊胚胎成纤维细胞，经72 h 培养及流式细胞仪检测，与对照组细胞比较，结果表明 HR 质粒重连效率提高了3~4倍。瞬间干扰 Lig4基因的表达可提高 HR质粒重连效率，为改善绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率提供理论基础。

绵羊胚胎成纤维细胞饲养层用于培养人诱导性多能干细胞的效果研究

试验在体外分离培养1月龄绵羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblast,SEF),经丝裂霉素C处理后探讨其作为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)体外培养饲养层的可行性。试验以SNL饲养层细胞为对照,人iPSC(hiPSC)为培养对象,通过形态学观察、碱性磷酸酶(AP)染色、以及实时荧光定量PCR和免疫细胞化学对hiPSC标志基因mRNA和蛋白表达的检测,比较了SEF细胞和SNL细胞作为干细胞饲养层的效果。结果表明,在试验期内,与SNL饲养层体外培养的hiPSC相似,SEF饲养层体外培养的hiPSC在形态上呈集落样生长,增殖速度快;AP染色呈蓝紫色,能够维持未分化状态;能正常表达多能性标志基因。两种饲养层细胞培养的hiPSC多能性标志基因c-Myc、Klf4、OCT 4和SOX 2 mRNA的表达以及OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-60蛋白的表达并无显著差异(P>0.05)。本研究结果初步表明SEF可作为体外培养iPSC的饲养层细胞,为进一步建立可表达促生长因子的基因修饰SEF细胞系奠定了基础。

吉林省首批克隆绵羊（两只）在吉林省农业科学院畜牧分院诞生

2月2日，吉林省首批克隆绵羊（两只）在吉林省农业科学院畜牧分院诞生。这两只克隆绵羊是2010年9月4日通过将来源于新吉细毛羊的胎儿成纤维细胞注入去核卵母细胞重构胚胎，然后将重构胚胎移植到代孕母羊体内而成。该批次共移植绵羊受体16只，出生2只，

bFGF浓度对oESC-like增值、凋亡、多能性相关基因表达的影响

使用免疫荧光技术检测与增值、凋亡、多能性相关基因的表达水平。提高bFGF浓度可增强PCNA、Oct-4、Sox-2、Bax和Bcl-2的表达,同时使Bcl-2/Bax比值维持较稳定水平。结果表明提高bFGF浓度可增强oESC-like的增值能力和多能性,增强其抗凋亡能力以适应长期培养。