绵羊防御素(sBD1)mRNA在不同发育阶段的组织分布和定量分析

为确定绵羊防御素(Sheep beta defensin-1,sBD1)mRNA在组织器官中的分布和不同发育阶段的表达是否存在差异。利用RT-PCR(Reverse Transcription PCR)方法检测绵羊防御素sBD1 mRNA在组织器官的分布情况,通过荧光定量RT-PCR(Fluorescence quantitative RT-PCR)检测不同发育阶段绵羊防御素的表达差异。结果表明:在胎羊的舌、皱胃、十二指肠、空肠、盲肠检测到绵羊防御素sBD1 mRNA,在羔羊和成年羊消化道的舌、食道、瘤胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠和呼吸道的气管、肺均检测到绵羊防御素sBD1 mRNA,在各发育阶段的心、肝、肾以及羔羊、成年羊的淋巴结和体外培养的羔羊肺泡巨噬细胞均未检测到sBD1 mRNA;实时定量PCR比较表明,sBD1 mRNA在不同发育阶段皱胃、十二指肠和空肠表达量的高低为sBD1 mRNA表达量(羔羊)>sBD1 mRNA表达量(成年羊)>sBD1 mRNA表达量(胎羊)。绵羊防御素sBD1 mRNA主要分布在消化道和呼吸道,且在整个发育过程中是持续表达的,其在消化道表达量高低为sBD1 mRNA表达量(羔羊)>sBD1 mRNA表达量(成年羊)>sBD1 mRNA表达量(胎羊)。

绵羊防御素sBD-1 cDNA的克隆及序列分析

从成年绵羊舌表皮组织分离提取总RNA,经反转录PCR(RT PCR)扩增出绵羊防御素sBD 1cDNA,将扩增片段回收,重组插入克隆载体T vector,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定,结果扩增出cDNA215bp,与发表的绵羊sBD 1cDNA序列完全相同。该cDNA编码64个氨基酸,其中信号肽与前片段相同,成熟肽位于前片段的羧基端,由38个氨基酸残基组成。

绵羊防御素(sBD-1)cDNA的克隆及其植物中表达载体的构建

为了获得在植物中表达的绵羊防御素 ,从绵羊舌表皮组织中分离提取总RNA ,经逆转录PCR (RT PCR)扩增出绵羊防御素sBD 1全长cDNA ,回收扩增产物连接到克隆载体 ,测序分析表明该cDNA为 2 1 5bp ,与报道序列完全一致。将该序列替换插入质粒PBI1 2 1中的GUS编码序列 ,构建植物表达载体PBIC 35SsBD1 ,为进一步进行转基因植物和绵羊防御素功能的研究奠定了基础。

雌二醇对蒙古绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素(sBD-1)表达的影响

为了探索雌二醇与β-防御素（sBD-1）表达量的关系,体外模拟蒙古绵羊（Ovis aries）生理周期,用添加雌二醇浓度10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的培养液及不添加雌二醇的培养液（即对照组）分别培养蒙古绵羊输卵管上皮细胞,作用24 h、48 h、72 h后,提取细胞总RNA,应用SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR法进行定量分析。结果显示,添加不同浓度雌二醇培养的输卵管上皮细胞中sBD-1的相对表达量0.000 740~0.001 758,与对照组0.000 190之间差异显著（P〈0.05）,且小于10-8mol/L雌二醇添加浓度与sBD-1基因相对表达量变化基本呈正相关。此结果为进一步研究雌激素参与机体防御功能奠定了基础。

绵羊β-防御素的研究进展

β-防御素是由上皮细胞产生的富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,具有广谱抗微生物活性,可代替抗生素应用于畜牧生产实践中,保障畜产品的生物安全。文章对绵羊β-防御素的分布、结构、生物学功能以及体外表达等最新研究进展作一综述,旨在供研究者参考。

脾酪氨酸激酶参与酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)的表达

为了探索脾酪氨酸激酶(Syk)是否参与酿酒酵母甘露聚糖(S.c M)诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)β-防御素-1(SBD-1)表达的过程,首先利用免疫组化、RT-PCR和免疫荧光等方法检测Syk在ORECs内的表达情况;然后采用qPCR和Western blot方法检测S.c M刺激ORECs后Syk的表达变化,同时用Western blot方法检测Syk的磷酸化水平;接着用3条Syk特异性siRNAs(#1、#2和#3)转染ORECs 24 h后,qPCR检测Syk mRNA的表达变化,筛选出干扰效果最佳的Syk siRNA;最后用效果最佳的siRNA和Syk特异性抑制剂R406分别处理ORECs后,采用qPCR和ELISA检测SBD-1的表达变化,以确定Syk在S.c M诱导SBD-1表达过程中的作用。结果显示:Syk在ORECs内表达;且S.c M刺激ORECs后Syk的mRNA和蛋白表达水平显著高于未刺激组(P<0.01或P<0.05),S.c M刺激ORECs不同时间(5、15、30、45和60 min)均能使Syk发生磷酸化,且刺激15 min后磷酸化水平达到最大(P<0.01);此外,Syk的3条特异性siRNAs转染ORECs后Syk的表达均降低,且Syk siRNA#2的抑制效果最明显(P<0.01);同时Syk siRNA#2和R406均能极显著降低S.c M诱导ORECs SBD-1的表达(P<0.01)。上述结果表明,Syk参与S.c M诱导ORECs SBD-1的表达。

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2表达的影响

研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2(SBD2)基因表达的影响,探讨P4调节SBD2表达的潜在机制。建立绵羊输卵管上皮细胞体外培养体系,用不同浓度(10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol/L)P4分别处理绵羊输卵管上皮细胞0、2、6、12、24、48h,筛选P4诱导绵羊输卵管上皮细胞SBD2mRNA表达的最佳条件。然后使用10-6mol/L孕激素核受体拮抗剂RU486,50μmol/L蛋白激酶C(PKC)信号通路阻断剂H7预处理细胞1h,再使用P4诱导SBD2mRNA表达的最佳条件处理细胞,同时设只添加阻断剂(RU486和H7)处理组、只添加孕酮(P4)处理组和空白对照组,通过RT-qPCR技术检测SBD2mRNA的表达变化。10-9mol/LP4诱导绵羊输卵管上皮细胞6h和24h时SBD2mRNA表达显著高于对照组(P<0.01),且与P4组相比,添加RU486和H7后显著抑制了P4诱导的SBD2mRNA的表达水平(P<0.01)。P4以浓度和时间依赖性方式显著增加SBD2mRNA表达,并且诱导可能通过孕酮核受体(PR)介导的基因组途径以及PKC信号通路来提高绵羊输卵管上皮的先天免疫防御能力。

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1 mRNA表达的影响

旨在研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素-1(SBD-1)mRNA基因表达的影响及可能参与的信号通路,利用10-8 mol/L P4培养绵羊输卵管上皮细胞2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,利用RT-qPCR技术检测SBD-1 mRNA的表达变化,选取P4诱导SBD-1 mRNA表达的最佳时间。分别添加P4核受体阻断剂RU-486、蛋白激酶C(PKC)阻断剂H-7、蛋白激酶A(PKA)阻断剂H-89干预绵羊输卵管上皮细胞1 h,再使用P4处理细胞。结果显示,用10-8mol/L P4诱导绵羊输卵管上皮细胞6 h,SBD-1 mRNA表达显著升高;添加RU-486和H-89显著抑制P4诱导的SBD-1 mRNA的表达;添加H-7后SBD-1 mRNA的表达量无显著性差异。以上结果表明,P4诱导的绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1 mRNA的表达通过孕酮核受体(PR)和PKA信号通路介导,与PKC信号通路激活无关。

LPS通过TLR4影响绵羊输卵管上皮细胞SBD-1的表达

旨在研究脂多糖(LPS)对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响及其调控途径,本研究设置不同浓度(10ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1、1mg·mL-1)LPS,分别作用不同时间(0、1、3、6、12和24h),检测绵羊输卵管上皮细胞SBD-1和Toll样受体-4(TLR4)mRNA表达水平,通过免疫组化检测SBD-1表达定位,并进一步通过TLR4阻断试验来证实TLR4介导LPS引起SBD-1表达。结果表明,SBD-1蛋白表达于输卵管上皮细胞。LPS以浓度和时间依赖方式影响绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1的表达,且100ng·mL-1 LPS在作用12h后,SBD-1的表达水平达到最高。阻断试验表明,TLR4介导LPS对SBD-1的表达调控。综上表明,LPS可以影响绵羊输卵管上皮细胞表达SBD-1,且该过程通过TLR4介导。

绵羊β-防御素在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

根据GenBank中绵羊β-防御素(SBD-1)的全长cDNA序列设计合成1对引物,PCR扩增SBD-1基因并与T载体成功连接,然后将其成熟肽编码片段亚克隆到毕赤酵母表达载体Ppic9k上,构建真核表达质粒Ppic9k-mSBD-1,将其在毕赤酵母GS115中进行分泌表达,表达产物纯化后进行活性鉴定。结果表明,mSBD-1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,而且对金黄色葡萄球菌的抑制作用更为明显。