绿脓杆菌ATCC9027外毒素PE40基因克隆与系统发育分析

目的为获得用于构建免疫毒素弹头的毒素蛋白基因,克隆绿脓杆菌外毒素PE40基因。方法 PCR扩增ATCC9027外毒素PE40基因,纯化PCR产物与T载体连接后转染感受态大肠杆菌JM109,蓝白斑筛选阳性克隆,HindⅢ酶切和测序鉴定阳性克隆。将ATCC9027的PE40基因进行blast搜索,以Genbank中所有的绿脓杆菌外毒素PE40基因为内群,以白喉毒素基因为外群进行系统发育分析。结果 PCR产物为1 098 bp。与PA103相比,ATCC9027外毒素PE40基因有14个碱基的突变,导致外毒素蛋白8个氨基酸的突变。系统发育树显示绿脓杆菌外毒素PE40基因形成单系群,ATCC9027和ATCC927853的亲缘关系最近。结论 ATCC9027外毒素关键位点的氨基酸未发生突变,获得了用于构建免疫毒素弹头的毒素蛋白基因PE40。

绿脓杆菌ATCC27853外毒素PE40基因的扩增与测序

目的扩增绿脓杆菌ATCC27853外毒素基因PE40,并对PCR产物进行测序鉴定,为获得用于构建分子导向药物的毒素弹头基因PE40奠定基础。方法采用PCR技术,以绿脓杆菌ATCC27853基因组DNA为模板,扩增PE40基因并测序。用DNASTAR软件将测得的序列与GenBank中的国际标准产毒株PA103的PE40基因序列进行比较。结果扩增出目的基因片断,长度为1231bp。测序表明,ATCC27853与PA103核苷酸同源性为98%,产生了7个碱基的突变,突变碱基导致第364位的天冬酰胺变成丝氨酸,第506位的丝氨酸变成色氨酸,第515位的丝氨酸变成甘氨酸。但产生变化的3个氨基酸均不是文献报道中的重要活性位点。结论产生变化的3个氨基酸不会对PEA的酶活性及细胞毒性产生很大影响,绿脓杆菌ATCC27853的PE40基因可用作分子导向药物的弹头。

抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。

抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40的基因构建及表达

目的 构建抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0并在大肠杆菌中表达。方法 从质粒pVC85中克隆出PE4 0基因 ,与抗胶质瘤单链抗体SZ39 ScFv基因进行拼接 ,构建出重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0基因 ,并将其克隆于表达载体pET2 0b(+) ,在大肠杆菌Bl2 1(DE3)pLysS中以IPTG诱导表达。结果 SDS PAGE分析显示表达产物主要以包涵体的形式存在 ,分子量为 6 8kD左右 ,与SZ39(ScFv) PE4 0的分子量理论推算值相符 ;Westernblot显示在 6 8kD处出现特异性显色印迹 ;凝胶灰度扫描显示其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。结论 重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0可经原核表达载体 ,pET2 0b(+)在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中以包涵体形式得到较高效率的表达。

抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素基因的克隆与表达

目的扩增抗癌胚抗原单链抗体(CEA-ScFv),与绿脓杆菌外毒素(PE40)进行重组及原核表达,旨在进一步研究重组蛋白CEA-ScFv-PFA0的靶向抗肿瘤作用。方法分别扩增抗癌胚抗原单链抗体的重链区、轻链区,用overlap PCR按照VH-VL的顺序连接,克隆至pMD18T载体中。再将VH-VL基因片段与含有.PE40的表达载体pET28a连接,转化B121(DE3),IPTG诱导表达。结果经DNA测序,其结果与设计完全相符。SDS-PAGE分析,在相对分子质量66000处可见明显表达带,表达量可占菌体蛋白总量的13％以上。免疫印迹表明重组蛋白具有PF40的抗原特异性。结论抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素的成功克隆与表达,为进一步研究其生物活性奠定基础。

LHRH-PE40与宫颈癌组织结合特性的研究

目的观察LHRH-PE40对各种病理型宫颈癌组织的结合能力,为其临床应用提供理论依据。方法采用免疫荧光法检测LHRH-PE40与正常宫颈组织及宫颈癌组织的结合能力。结果宫颈结缔组织、鳞状上皮的荧光结合率为0%。宫颈癌组织荧光结合率为74%,弱阳性及阴性表达病例中,高分化鳞状细胞癌占67%,中低分化鳞状细胞癌占15%,两者差异有显著意义(P<0.05)。中强阳性表达病例中,高分化鳞状细胞癌仅占37%,中低分化鳞状细胞癌占86%,两者差异有显著意义(P<0.05)。5例强阳性表达病例均为高分化腺癌。结论高分化鳞状细胞癌与LHRH-PE40结合能力最弱,子宫颈腺癌与LHRH-PE40结合能力最强。

LHRH-PE40与正常肝组织和肝癌细胞表面LHRH受体结合特性的比较研究

目的 探讨重组促性腺激素释放激素 绿脓杆菌外毒素 4 0 (LHRH PE4 0 )与正常肝脏组织和肝癌细胞表面受体结合特性的差异。方法 用放射性配基结合分析的方法测定亲和力和受体容量。结果 LHRH PE4 0与肝癌细胞HEPG细胞的亲和力Kd为 (0 .4 3± 0 .12 )nmol·L-1,受体容量Bmax为 (0 .37± 0 .15 )nmol·mg-1,与正常肝脏组织未见结合。结论 重组毒素LHRH PE4 0和肝癌细胞HEPG的表面受体有较强的结合 ,而和正常肝脏组织无特异性结合。

LHRH-PE40对宫颈癌细胞株细胞周期及Ki-67、Bcl-2的影响

目的观察LHRH-PE40对宫颈癌Hela细胞系凋亡及增殖的影响,为其临床应用提供理论依据。方法采用人宫颈癌Hela细胞株进行培养,在培养液中分别加入不同浓度的LHRH-PE40,作用48h后,观察Hela细胞形态的变化,并通过结晶紫染色法检测宫颈癌Hela细胞株对LHRH-PE40的感受性;用流式细胞仪及免疫组化法检测LHRH-PE40对Hela细胞周期、Ki-67及Bcl-2的影响。结果LHRH-PE40对Hela细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性,通过量效曲线可以看出,LHRH-PE40的最小有效剂量为0·625μg/ml;半数致死剂量为0·969μg/ml。在1·0μg/ml浓度下,癌细胞中的Ki-67阳性细胞(用药前80%,用药后42%)及Bcl-2阳性细胞(用药前66%,用药后43%)比率均下降,凋亡细胞比率增加(由0增加到3·7%)。在1·0μg/ml浓度下,细胞的G0/G1期细胞比率增加15·21%;S期细胞变化不大,而G2/M期减少38·28%。结论LHRH-PE40可以有效地抑制宫颈癌细胞的增殖,诱发肿瘤细胞凋亡,是一种很有应用前景的抗肿瘤药物。

抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测

目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(sc Fv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达,蛋白经变复性和镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化后进行Western blot鉴定;间接ELISA和流式分析技术进行特异性鉴定。利用MTT法和皮下移植瘤模型实验,检测毒素对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。结果:酶联后得到重组表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,纯化后的毒素蛋白对肿瘤细胞具有一定杀伤力,并且在肿瘤模型实验中能抑制体内肿瘤的生长。结论:成功构建了基于抗B7-H4单链抗体的重组毒素表达体系,经鉴定重组毒素蛋白有良好的生物学功能活性和抗肿瘤活性。

猪囊尾蚴头节单链抗体-PE40重组载体的构建及表达

从绿脓杆菌ATCC27853菌株中提取基因组,PCR扩增PE40基因,与pMD18-T载体连接并转化感受态大肠杆菌JM109中,构建重组质粒pMD-PE40;经鉴定正确后将PE40基因插入抗猪囊尾蚴头节单链抗体基因重组质粒pMD-ScFv中,构建重组质粒pMD-ScFv-PE40,经酶切、电泳回收目的片段,并亚克隆到表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-ScFv-PE40;鉴定后转化E.coliBL21,IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western-blotting验证。结果表明,试验成功构建了重组表达载体pET-ScFv-PE40,目的片段约为1 800 bp;Western blotting证明重组蛋白具有一定的反应原性,为重组免疫毒素的制备及动物保护性试验奠定了基础。

LHRH-PE40对黑色素瘤A375细胞的诱导凋亡作用

目的 研究促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素(Luteinizing hormone releasing hormone-Pseudomonas aeru-gionosa exotoxin 40,LHRH-PE40)对黑色素瘤A375细胞的诱导凋亡作用。方法用LHRH-PE40处理A375细胞,透射电镜观察细胞结构的改变;DNA ladder和流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果经LHRH-PE40作用后,透射电镜观察可见A375细胞核聚集于一侧;DNA ladder检测发现,A375细胞的DNA电泳图像呈梯形条带;流式细胞术检测结果显示,A375细胞出现明显的二倍体峰,细胞周期也发生了相应的改变。结论 LHRH-PE40对A375细胞的细胞毒性作用可以有效诱导A375细胞凋亡。