增强型绿色荧光蛋白与单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶共表达质粒载体构建及在肝癌细胞株HepG2表达的研究

目的构建增强型绿色荧光蛋白与单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因的真核共表达质粒载体pIRES2-EGFP-TK,并鉴定其在肝癌细胞株HepG2中转染和表达。为肝癌靶向基因治疗提供实验依据。方法2008年6月重庆医科大学附属第二医院从含有目的基因的质粒PORF-HSV1-TK中获得HSV1-TK基因片段,连接到增强型绿色荧光蛋白共表达载体pIRES2-EGFP,得到重组质粒pIRES2-EGFP-TK并进行鉴定、测序。将重组质粒用脂质体法转染肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)在细胞内的表达,逆转录聚合酶链反应RT-PCR检测胸苷激酶TK的mRNA表达水平,免疫印迹Western blotting法检测TK蛋白表达情况,新霉素类似物G418筛选出阳性克隆。结果重组克隆载体内的TK序列与GeneBank报告的序列完全一致。肿瘤细胞转染后在荧光显微镜下可观察到有绿色荧光出现,G418筛选的最佳浓度为600mg/L,TK的mRNA表达水平高,TK蛋白有明显表达。结论实验成功构建EGFP和TK真核共表达载体,在肝癌细胞能有效的表达。