具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶稳定细胞系的建立

[目的]建立具有绿色荧光标记表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21(DE3)大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆质粒FG12后,构建了表达T7 RNA聚合酶基因(T7)的Lenti-virus重组质粒FG12-T7 RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7 RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7 RNA聚合酶。[结论]T7 RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。

具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系的建立(英文)

[目的]建立具有绿色荧光标记的表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21(DE3)大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆进质粒FG12后,构建了表达T7RNA聚合酶基因(T7)的Lenti-virus重组质粒FG12-T7RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7RNA聚合酶。[结论]T7RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。

绿色荧光蛋白标记的枯草芽胞杆菌R31在西芹根际定殖研究

为了更直观地了解植物内生枯草芽胞杆菌R31在西芹根际定殖情况,评估其定殖能力,为西芹黄萎病生物防治提供依据。通过原生质体转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pHT315-gfp导入枯草芽胞杆菌R31细胞中,对菌株进行gfp标记,然后利用gfp标记菌株灌根处理西芹苗,研究其在西芹根际的定殖形式和能力。结果获得了携带pHT315-gfp质粒的R31-gfp菌株,该质粒可以在R31细胞中稳定表达,标记菌R31-gfp在蓝光激发下可以稳定发出强的绿色荧光。利用标记菌接种西芹幼苗后,可以在根系表皮检测到绿色荧光膜。对其定殖量的检测发现,接种3天后标记菌在根表和根际土中稳定定殖,定殖量分别达到1.4×104cfu/g和7.6×104cfu/g,并长期以该水平稳定定殖,到第65天仍可在根表和根际土检测到9.1×104cfu/g和3.17×105cfu/g的R31-gfp。由此得出,R31可以在西芹根表形成菌膜,并在根际长期稳定定殖。

芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记及其在小麦体表定殖的初探

将来自质粒 pAD4 4 12的启动子和绿色荧光蛋白基因 gfpmut3a插入大肠杆菌 枯草芽孢杆菌穿梭载体pBE2 ,构建成芽孢杆菌表达载体 pGFP4 4 12 ,用其转化野生型生防芽孢杆菌 83 6和A 4 7等 8个菌株 ,均得到良好的发光表型。质粒稳定性实验表明重组质粒 pGFP4 4 12稳定性为 92 %。借助荧光显微镜对GFP标记的菌株A 4 7 gfp在小麦体表的定殖进行初步的研究。结果表明 :A 4 7 gfp能够在小麦根际及小麦体表定殖 (包括根表和茎叶表面 ) ;相对于在茎叶表面定殖的A 4 7 gfp在根表定殖的菌体与根的结合更为牢固 ;从根基到根尖A 4 7

生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03的绿色荧光蛋白基因标记及其在柑橘叶片上的定殖

【目的】利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因标记枯草芽孢杆菌生防菌株CQBS03,以研究其在柑橘叶片上的定殖规律。【方法】采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合,并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接构建重组质粒pHY43G,以重组质粒电脉冲转化生防菌株CQBS03,培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析工程菌株GFP的表达情况,然后进行工程菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用叶片喷雾方法接种,平皿稀释分离培养方法测定CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。【结果】重组菌CQBS03-pHY43G高效表达GFP,电泳后出现约29kDa的特异蛋白条带,外源质粒对宿主菌的生长未带来明显不利影响,质粒稳定性实验表明重组质粒pHY43G经30次传代后的稳定性为55%,室内平板抑菌实验结果显示CQBS03-pHY43G对柑橘溃疡病菌生防效果与出发菌株没有明显差异(P<0.01),CQBS03-pHY43G菌株在叶片喷雾接种后的0—15d,在柑橘叶片上的数量呈现急剧下降趋势,15d后下降速度稍缓,最后保持相对稳定的较低水平(1.73×103cfu·g-1)。【结论】成功地将gfp转入野生型枯草芽孢杆菌生防菌CQBS03中,构建了荧光标记菌株,初步明确了生防菌的定殖规律。

绿色荧光蛋白标记检测枯草芽孢杆菌在水体中的存活动态

基于生物-化学协同控制植物病害的原理,构建了一种由枯草芽孢杆菌和烯酰吗啉组成的对辣椒等作物疫病具有较好的防治效果的菌药合剂(DMBS)。按照农药降解研究基本规则,采用绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)标记技术和细菌学研究方法研究了DMBS在去离子水、地下水、自来水、河水和雨水中的降解动态。结果表明,GFP标记可以用于枯草芽孢杆菌在5种水环境中的存活检测。在(25±1)℃条件下,枯草芽孢杆菌菌剂和DMBS中的枯草芽孢杆菌数量主要表现为前12 d迅速下降,此后则随时间的延长在一定的范围内呈变动的上升或下降趋势。在(50±1)℃灭菌和不灭菌的条件下,均表现为前12 d迅速下降,12 d后趋于稳定或缓慢下降。枯草芽孢杆菌在5种水中的降解速度较慢,在(25±1)℃和(50±1)℃条件下存放86 d后,其含量均在104cfu/mL以上。培养温度和灭菌条件对枯草芽孢杆菌在不同水体中存活动态有一定的影响,菌药合剂中的烯酰吗啉对该菌的存活则没有显著影响。

绿色荧光蛋白标记的芽孢杆菌在幼龄畜禽体内的动态分布

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组芽孢杆菌(Baci1010).以GFP为标记研究该工程菌在仔猪和小鸡体内的动态分布.试验结果表明:投喂含质量分数为0.1%工程菌(Baci1010)菌液的全价配合饲料12h后,在仔猪和小鸡的肠道内可检测到该工程菌的存在,36h后在小鸡盲肠内该工程菌的数量达到(155±33)×105个/g,48h后在仔猪盲肠内该工程菌的数量达到(133±35)×105个/g,在仔猪和小鸡体内,该工程菌都能在肠道内迅速复活并繁殖成为有益菌.

绿色荧光蛋白标记的嗜水气单胞菌在越冬水体的饥饿存活及复苏

将绿色荧光蛋白标记的嗜水气单胞菌 (Ah4332 GFP)置模拟越冬水体 ( 8— 1 0℃ )内 ,进行饥饿存活试验 ,用三种计数方法检查水体中的细菌数量变化。在 41d后平板计数法 (PC)降至0 ,而细菌总数法 (DC)和活菌直接计数法 (DVC)结果相似 ,只是DVC计数结果低于细菌总数1— 2个数量级。显示细菌已经变成活的非可培养 (Viablebutnonculturable ,VBNC)状态。复苏试验表明 ,升高温度、添加鱼血清或新鲜培养的Ah4332 GFP细菌上清及通过兔肠管结扎 ,均使VBNC状态的Ah4332 GFP得到复苏。荧光显微镜和电镜观察处于可培养和VBNC状态的Ah4332 GFP,后者的细菌细胞比前者体积明显缩小 ,形态由杆状变成了球形 ,但细胞膜和细胞壁是完整的 ,不是细菌L型。

绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建

为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载体成功地表达并纯化了酵母GGDP(geranylgeranyldiphosphate,GGDP)合酶融合蛋白,结果表明所构建的载体是一个实用的表达载体,并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法。

干细胞脑内移植有效标记研究:绿色荧光蛋白质粒标记的应用价值

目的:观察绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)质粒转化小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)的效果,以及将转化的胚胎干细胞移植入正常大鼠纹状体后,GFP质粒作为细胞存活情况示踪剂的效果。方法:首先利用感受态大肠杆菌提取大量高纯度GFP质粒DNA,然后将GFP质粒与脂质体孵育形成的转化复合物和小鼠胚胎干细胞共同孵育,使GFP质粒转入胚胎干细胞;筛选表达GFP的胚胎干细胞。将筛选后表达GFP的ESC移植入活体大鼠纹状体内,移植21d后,观察表达绿色荧光蛋白的移植细胞的存活情况。结果:GFP质粒转化以后的ES细胞团和单细胞都表达亮绿色的GFP,细胞打散计数证实大约60%的细胞携带GFP,移植21d后,大鼠脑内可见大量表达GFP的移植细胞。结论:脂质体可以将GFP质粒转入鼠的胚胎干细胞,携带有GFP的ES移植后21d,GFP可以作为示踪剂观察移植细胞的存活状况。脂质体辅助的GFP质粒转化胚胎干细胞是移植示踪的较好方法。

生防链霉菌SSD49的绿色荧光蛋白标记及其在毛白杨组培苗中的定殖

杨树溃疡病是中国杨树人工林重大生物灾害之一,采用生物防治的方法控制杨树溃疡病是持续有效的手段。为了获取能够高效定殖并对杨树溃疡病菌有良好生防效果的拮抗菌株,通过引入强启动子(erm Ep)构建了高表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的重组质粒,进而通过接合实验将该质粒导入到链霉菌生防菌株SSD49,构建了绿色荧光蛋白标记菌株SSD49-p IJ8660Ep,利用荧光显微镜研究该生防菌在毛白杨组培苗中的定殖情况。结果表明,SSD49标记绿色荧光蛋白后没有影响其对杨树溃疡病病原菌的抑菌活性,标记菌株能够定殖于毛白杨组培苗的茎和叶中。成功将杨树溃疡病生防菌株SSD49进行了绿色荧光蛋白标记,并且该菌株在毛白杨组培苗中有一定的定殖能力。

应用绿色荧光蛋白标记技术研究钙调激Ⅱ在HeLa细胞中的分布

采用绿色荧光蛋白 (GFP)标记技术研究钙离子钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ )在HeLa细胞中的分布 .为了研究细胞内钙离子钙调素信号的下游作用物 ,我们首先构建了CaMKⅡ与GFP的融合基因 ,磷酸钙沉淀法将pCaMKⅡ -GFP重组载体导入HeLa细胞 .通过荧光显微镜观察 ,发现在细胞间期 ,CaMKⅡ -GFP融合蛋白主要分布于细胞核中 ,细胞质中亦有少量分布 ,这一分布不同于绿色荧光蛋白在间期细胞内的均匀分布 .同时讨论了与间接免疫荧光染色方法相比 ,GFP技术在功能蛋白定位研究上的应用优势 .

增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞体外诱导分化成心肌样细胞研究

急性心肌梗死后心肌细胞的数量减少，致使其向心力衰竭发展。但是现有的治疗手段并不能很好地解决心力衰竭问题，细胞替代治疗和基因治疗为心力衰竭的治疗带来了新的希望。而替代治疗的关键问题是种子细胞的选择。间充质干细胞（MSC）具有高度的自我更新和多向分化的潜能，被认为是理想的种子细胞和基因转移的载体细胞，但其在体内的转归是研究的难点。近期，我们采用不同浓度的转染液转染，以便确定转染浓度对转染效率的影响，并明确经蛋白标记后的心肌细胞是否可以稳定生长、建系并被在体外诱导为心肌细胞，以及微环境究竟如何诱导转染MSC在体外向心肌细胞分化，为进一步的体内研究提供实验依据。

绿色荧光蛋白标记解淀粉芽孢杆菌Bam22在油菜体内的定殖

研究GFP标记的解淀粉芽孢杆菌Bam22在油菜植株上的定殖规律,为其开发利用提供科学依据。采用自然转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pGFP4412导入Bam22细胞中,构建GFP荧光标记菌株;对比野生型菌株Bam22与标记菌株Bam22-GFP的生长曲线和抑菌能力;通过灌根法,观察标记菌株在油菜体内不同组织部位的定殖数量,分析其定殖规律及能力。结果表明,标记菌株Bam22-GFP在激发光波长为488 nm的蓝光下发出强烈的绿色荧光,且GFP荧光蛋白标记及其基因表达不影响解淀粉芽孢杆菌Bam22的生长曲线和抑菌能力。标记菌株能够通过灌根法定殖于油菜植株内部,并由根部传导到油菜茎部和叶部,Bam22-GFP在根、茎、叶的定植规律均表现出先上升后下降趋势。接种后第45天,仍能在油菜的根、茎、叶组织中检测到标记菌株。说明解淀粉芽孢杆菌Bam22能通过灌根法在油菜体内定殖并传导,有较好的定殖能力,在农业上具有良好的应用前景。

绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨构建中的示踪作用

目的:探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用。方法:实验于2003-09/12在第三军医大学西南医院中心实验室完成。选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体,麻醉处死后,切取关节软骨,系列酶消化分离软骨细胞,洗涤,37℃于体积分数为0.05的CO2中培养,传代扩增。再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体。首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞,将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周,再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损。倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况。结果:实验共纳入4只日本大耳白兔,作为受体的2只进入结果分析。①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况:转染后3d,倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞,主要为三角形,少数呈多角形和梭形。随着传代次数的增加,绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主,少数细胞为三角形和椭圆形,体外培养8周,细胞增殖良好,荧光强度无减弱。流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87.3%。②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果:软骨细胞三维接种支架后,细胞几乎全部种植于支架上,在支架材料内分布均匀,刚接种的细胞呈圆形,发出明亮的绿色荧光;3～4h细胞开始变形,2～3d即己基本完全变形,细胞的形态以长梭形为主,呈网状排列,随着培养时间延长,支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形,移植前(体外培养3周)支架上细胞大多数己呈圆形。体外培养6周,细胞密度增加,荧光强度未见减弱,而不能在荧光显微镜下观察未标记软骨细胞～支架复合物中细胞的形态。③绿色荧光蛋白标记关节软骨细胞在修复区成活及参与软骨缺损修复情况:移植术后4周,大体观察可见移植组织有别于周围软骨,表面尚平整。绿色荧光蛋白标记软骨细胞～支架复合移植修复关节软骨缺损4周,苏木精-伊红染色可见修复区细胞为透明软骨样细胞,排列不规则,表层细胞体积较小,数量较多,深层细胞体积较大,细胞外基质较少,与周围组织分界清楚。甲苯胺蓝染色可见修复区甲苯胺蓝阳性的基质较少,支架材料大部分降解吸收,修复区与周围组织分界清楚,连接处稍不平整,未见淋巴细胞浸润。倒置荧光显微镜进行观察,修复区可见发绿色荧光的圆形细胞及其分裂相,荧光充满整个细胞,荧光细胞未进入周围的软骨及软骨下骨中,与周围正常关节软骨分界清楚。结论:反转录病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染对关节软骨细胞的黏附、伸展、生长和增殖等功能没有明显的影响,可长期稳定的标记关节软骨细胞以及动态观察软骨细胞的生长和增殖等情况,对组织工程软骨体外构建和体内软骨形成有良好的示踪作用。

荧光蛋白标记/高效液相色谱分析枯草芽孢杆菌-烯酰吗啉菌药合剂

生物和化学组分构建的菌药合剂是新农药制剂发展的热点,其中生物活体和化学组分的准确、快速检测方法备受关注。本实验应用绿色荧光蛋白标记和高效液相色谱技术研究了枯草芽孢杆菌-烯酰吗啉菌药合剂在54±2℃贮存14d前后生防菌株和化学组分含量的变化。结果表明:绿色荧光蛋白标记和高效液相色谱技术联用,可以用于该菌药合剂质量检测和热贮实验中混剂的贮存稳定性监控;菌药合剂在热贮实验过程中的组分含量变化在允许变化范围之内。

pBBR1MCS2-Tac-EGFP广宿主载体适宜标记Ralstonia solanacearum

利用标记基因追踪病原菌在植物体内的入侵和定殖,是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用电转化法将广宿主载体pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)GMI1000菌株中,获得了青枯雷尔氏菌带绿色荧光标记的转化子。转接试验结果表明,转化子的抗生素抗性和绿色荧光强度有良好的遗传稳定性。pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影响GMI1000菌株的致病力,且EGFP蛋白能够在植物中稳定表达。灌根法接种试验结果表明,病原菌在第1天即完成对根系的侵染,并在第6天扩散至其他组织,随后造成植株萎蔫。研究结果表明所获转化子可用于后续的病原菌侵染机理等方面的研究。

生防枯草芽孢杆菌Kct99的GFP标记及其在甘蓝根部的定殖示踪

将含有绿色荧光蛋白基因的质粒pGFP4412,电击转入生防菌株枯草芽孢杆菌Kct99,获得具有良好发光表型的荧光标记菌株gfp-Kct99。经稳定性测定表明,质粒pGFP4412在gfp-Kct99中的遗传稳定性为89%。平板对峙培养和温室盆栽接种试验显示,标记菌株gfp-Kct99对甘蓝枯萎病菌保持了原有的拮抗活性;以标记菌株和野生型菌株培养液对甘蓝盆栽苗灌根处理5 d后再接种病原菌,对甘蓝枯萎病的防治效果分别为87.7%,90.2%,二者无显著性差异,但均显著高于同时接种生防菌和病原菌、接种病原菌5 d后再接种生防菌2种处理,说明,绿色荧光标记菌株gfp-Kct99抗甘蓝枯萎病的活性未受标记基因的影响。借助荧光显微镜观察表明,标记菌株可以在甘蓝根部表皮内大量定殖,从而阻止病原菌的侵入。

腐烂病菌的GFP标记及其在梨叶片组织中的侵染和扩展观察

【目的】明确梨腐烂病菌强、弱致病力菌株在梨树叶片组织中的侵染及扩展情况。【方法】利用农杆菌介导的遗传转化(agrobacterium-mediated transformation technique,ATMT)方法对梨腐烂病菌强、弱致病力菌株进行绿色荧光蛋白(green looresent protein,GFP)标记,并筛选出和野生型菌株比较在生长速度、培养特性以及致病力都没有发生显著变化的阳性转化子菌株;利用荧光显微技术观察其在梨树叶片组织中的侵染和扩展,比较强、弱致病力菌株的侵染差异。【结果】强、弱致病力菌株在叶片上侵染存在差异。菌丝主要在叶片的上表皮扩展,菌丝扩展前端的叶片组织颜色发生变化,形成一段变色带,强致病力菌株侵染形成的变色带较弱致病力菌株形成的变色带宽,强致病力菌株菌丝在叶片组织上的分布较稀疏。【结论】梨腐烂病菌菌丝主要在叶片的上表皮组织扩展;强致病力菌株的侵入能力较强,其在叶片上扩展时菌丝分布较稀疏,扩展前端形成的变色带宽。

应用GFP标记技术示踪裸鼠体内组织工程化骨的形成

目的 应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法 用GFP重组逆转录病毒载体(GFP-RV)转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs),将其接种于β-磷酸三钙(β-TCP),形成细胞一材料复合物,移植于裸鼠皮下。术后8周,HE染色观察组织结构,碱性磷酸酶(AKP)染色和骨钙素(OCN)免疫组化检测功能蛋白,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察。结果 8周后,大体可见组织工程化新骨形成,组织学示新生骨小梁围绕材料孔隙生成,AKP染色和OCN免疫组化结果阳性,并可见新生组织内有呈绿色的GFP标记细胞,β-TCP部分降解。结论组织工程化骨组织学结构与松质骨小梁类似。新生组织表达GFP,证实组织工程化骨组织的形成来源于供体细胞。