绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定

绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原核表达系统,然后通过Ni-NTA亲和层析和Mono Q阴离子交换层析纯化,每升菌液能够得到超过43mg、纯度超过95%的重组GBP1蛋白.我们通过MALDI-TOF/TOF质谱法测定纯化的GBP1的精确分子量,通过微量热泳动(MST)和等温滴定量热(ITC)实验检测GBP1与7种不同来源荧光蛋白的亲和力.结果显示GBP1特异性地与源自Aequorea victoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白相互作用,与RFP和Zoanthus GFP等无相互作用.GBP1与EGFP和sfGFP的亲和力最高,与YPet和T-Sapphire的亲和力稍弱,与CyPet的亲和力最低.

表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定

报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′UTR间引入外源基因EGFP,通过融合PCR获得全长cDNA PCR产物,体外转录生成mRNA,转染至BHK-21拯救重组病毒并研究其生长特性。结果显示,利用5′UTR-C位点构建的报告病毒mRNA转染BHK-21细胞后能观察到明显的绿色荧光;报告病毒P0接种DEF细胞后可高强度表达绿色荧光蛋白,在BHK-21和DEF细胞上增殖速度略微低于亲本毒株,但差异不显著。结果表明,成功构建了1株坦布苏绿色荧光报告病毒rJXSP-5′EGFP,在BHK-21和DEF细胞上均能有效增殖。

一种诱导表达绿色荧光蛋白穿梭质粒的构建及其在荧光示踪中的应用

细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究构建了一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒pBT-iEGFP,该质粒可通过添加无水四环素诱导表达绿色荧光蛋白。诱导表达和传代稳定性试验表明,pBT-iEGFP质粒可在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中成功诱导表达绿色荧光蛋白,在五代盲传中该质粒能在细菌中稳定遗传。胞内布鲁菌诱导表达试验证实,pBT-iEGFP质粒可成功示踪细胞感染过程中活的布鲁菌。总之,本研究构建的pBT-iEGFP质粒可作为细菌的荧光示踪研究工具,应用于多种实验研究。

表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化

【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和T7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。

利用绿色荧光蛋白优化辣椒遗传转化体系

【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘8214’和‘L55’)中3种不同外植体(子叶、下胚轴和Flamingo-bill外植体)的不定芽分化率、不定根分化率与荧光阳性率,探究农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等因素对不定芽、不定根分化率及荧光阳性率的影响。【结果】3个辣椒品种的Flamingo-bill外植体不定芽分化率均显著高于下胚轴与子叶外植体,其中‘L55’Flamingo-bill外植体的不定芽分化率最高、达77.59%,故选用‘L55’Flamingo-bill外植体进行后续研究。4种农杆菌不同侵染浓度和时间组合下,‘L55’Flamingo-bill外植体均可产生不定芽、不定根及表达GFP的愈伤组织,当农杆菌侵染浓度为OD_(600)=0.05,侵染时间为30 min时,不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.39%、4.84%。在6种不同预培养与共培养时间组合处理下,Flamingo-bill外植体也均产生不定芽和不定根,预培养1 d、共培养1~2 d处理下的不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.44%、12.50%。最后对表达GFP荧光的不定根与愈伤组织进行PCR检测,结果显示GFP、Kan和Cas9基因在荧光阳性的组织中均被检测到,表明农杆菌介导的T-DNA插入成功且转化稳定。【结论】辣椒的外植体类型、农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养和共培养时间均对辣椒遗传转化效率有影响。以GFP为报告基因,筛选合适的转化条件可提高农杆菌介导的辣椒遗传转化效率。

脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建

携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID50)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP基因的插入对EMCV病毒粒子的组装释放具有不良影响,并在传代过程中逐渐累积导致EGFP功能丧失的缺失和突变。

黄曲条跳甲短链气味结合蛋白基因PstrOBP-sc分子和功能特点分析

【目的】分析黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)短链气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBP)基因PstrOBP-sc分子和功能特点,为揭示昆虫短链OBP基因的功能提供参考。【方法】利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)克隆黄曲条跳甲短链Classic OBP基因,并对其进行生物信息学分析;通过逆转录聚合酶链反应技术分析短链OBP基因在黄曲条跳甲雌、雄成虫不同组织中的表达情况;构建重组表达载体异源表达短链OBP基因,以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证目的蛋白;运用荧光结合试验检测短链OBP的配体结合能力。【结果】通过逆转录聚合酶链反应克隆验证,成功获得1条具有完整开放阅读框的黄曲条跳甲短链OBP基因PstrOBP-sc。PstrOBP-sc基因含有1个357 bp的开放阅读框,编码118个氨基酸残基,N末端具有1个由20个氨基酸残基组成的信号肽,成熟蛋白PSTROBP-SC仅由98个氨基酸残基组成,序列中含有6个保守的半胱氨酸,属于典型短链OBP基因。蛋白二级结构预测结果显示,PSTROBP-SC蛋白仅存在5个α-螺旋,且在第5个α-螺旋的下游仅有2个氨基酸残基。PstrOBP-sc基因组织表达模式及异源表达的PSTROBP-SC蛋白配体结合能力研究结果表明,PstrOBP-sc基因在黄曲条跳甲雌、雄成虫的所有供试组织中均有表达,而非特异性表达于嗅觉器官。同时,异源表达PSTROBP-SC不能结合荧光探针1-NPN。【结论】PstrOBP-sc基因的分子和功能特点不同于当前广泛研究的中长链OBP基因,其在生物体内很可能行使嗅觉以外的其他生理功能。

建立检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2的mRNA相对表达水平的RT-qPCR方法

目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。

黏虫保幼激素结合蛋白基因MsJHBP3生物学功能及对黏虫生长发育的影响

保幼激素结合蛋白(juvenile hormone binding protein,JHBP)是一类载体蛋白,与保幼激素(juvenile hormone,JH)结合形成复合体后将保幼激素运送到靶器官处调控昆虫的生长发育。本试验在黏虫Mythimna separata转录组中获得7条保幼激素结合蛋白基因,筛选获得一条经保幼激素诱导后高表达的保幼激素结合蛋白MsJHBP3(GenBank登录号:MZ577068),c DNA全长为839bp,开放读码框长度729bp,编码242个氨基酸,氨基酸等电点为5.35,分子量为27.02kDa。不同发育阶段研究表明,Ms JHBP3在蛹期表达量最高,2龄表达量最低。RNA干扰处理4龄幼虫后6 h基因抑制效率最好,达79.72%。干扰后虫体内保幼激素含量为对照的1.14倍;羽化率和化蛹率均较对照组显著降低,羽化率下降7.42%,化蛹率下降3.75%;Ms JHBP3干扰后转录组测序数据分析共获得212个差异基因,其中105个上调基因,107个下调基因,其中保幼激素甲基转移酶基因、保幼激素环氧水解酶基因、保幼激素酯酶基因均上调。本研究表明MsJHBP3影响黏虫生长发育并参与调控JH代谢。本研究结果为黏虫生长发育关键基因的挖掘提供基础数据,为黏虫生物防治提供新的靶标基因和途径。

花蓟马化学感受蛋白FintCSP2与聚集信息素苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的结合特性

【目的】本研究旨在明确花蓟马Frankliniella intonsa化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)FintCSP2与聚集信息素苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯[neryl(S)-2-methylbutanoate]的结合能力。【方法】利用RT-PCR法扩增花蓟马FintCSP2的开放阅读框序列,并对其进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测FintCSP2在花蓟马雌成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹和足)中的表达量;利用RNAi通过向花蓟马雌成虫注射dsRNA沉默FintCSP2,24 h时通过触角电位(electroantennogram,EAG)实验检测花蓟马对苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的反应,利用Y型嗅觉仪测定花蓟马雌成虫对苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的的选择性;原核表达FintCSP2重组蛋白,利用荧光竞争结合实验检测FintCSP2重组蛋白与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合力;采用分子对接模拟技术和蛋白定点突变技术分析FintCSP2与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合的关键氨基酸残基。【结果】花蓟马FintCSP2(GenBank登录号:MT211602.1)开放阅读框长390 bp,编码129个氨基酸,N端有一个包含20个氨基酸的信号肽,含有4个保守的半胱氨酸。氨基酸序列分析结果表明,FintCSP2氨基酸与花蓟马CSP1(GenBank登录号:WBW64307.1)、西花蓟马F.occidentalis CSPs(GenBank登录号:WBW64306.1,AJL33750.1)和牛角花齿蓟马Odontothrips loti CSP2(GenBank登录号:WBU77202.1)的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性分别为99.22%,99.22%,86.05%和65.85%。RT-qPCR结果表明,FintCSP2在雌成虫各组织中均有表达,其中在触角中的表达量最高。与对照组(注射ds EGFP)比,沉默FintCSP2显著降低花蓟马对苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的EAG反应绝对值和选择率。分子对接预测Tyr24,Phe29,Leu38,Val71,Cys76,Cys79和Gln83这7个氨基酸残基最可能参与FintCSP2结合苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯;定点突变和荧光竞争结合实验结果表明,与野生型蛋白相比,FintCSP2-Tyr24Ala和FintCSP2-Gln83Ala突变蛋白与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合能力显著下降,FintCSP2-Phe29Ala突变体蛋白失去与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的结合能力。【结论】花蓟马FintCSP2蛋白在识别苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯过程中起关键作用,Tyr24,Phe29和Gln83是FintCSP2结合苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的3个关键氨基酸残基。

不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建

【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和mCherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和mCherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。

潜在转化生长因子β结合蛋白4影响肿瘤细胞伪足形成抑制结直肠癌转移的分子机制研究

目的 探究潜在转化生长因子β结合蛋白4(latent transforming growth factor beta binding protein 4,LTBP4)通过影响肿瘤细胞伪足形成从而遏制结直肠癌细胞转移的分子机制。方法 在结直肠癌细胞株DiFi中使用小干扰si-LTBP4敲减LTBP4,在结直肠癌细胞株HCT15中使用LTBP4过表达质粒过表达LTBP4。使用人源慢病毒在DiFi细胞株中稳定敲减/不敲减LTBP4构建稳转细胞株shLTBP4和shNC。Western blot法检测LTBP4、原肌球蛋白4(tropomyosin 4,TPM4)、金属基质蛋白酶14(matrix metalloproteinase-14,MMP14)及酪氨酸激酶底物5(tyrosine kinase substrate 5,TKS5)等蛋白。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测LTBP4及TPM4的表达。Transwell迁移实验检测敲低/过表达LTBP4后结直肠癌细胞的体外转移能力。使用裸鼠尾静脉注射shLTBP4或shNC稳转细胞株构建裸鼠肺转移模型及阴性对照,检测结直肠癌细胞敲减LTBP4后的体内转移能力。转录组测序检测差异基因表达情况。鬼笔环肽染色观察敲低LTBP4后细胞骨架改变及侵袭性伪足形成情况。结果 qPCR实验检测发现,LTBP4在DiFi、HCT8和KM12C细胞株中均高表达(均P<0.05),在HCT15和KM12SM细胞株中均低表达(均P<0.01)。Westen blot检测发现,LTBP4在DiFi、HCT8和KM12C细胞株中均高表达(均P<0.01),在HCT15、KM12SM及RKO细胞株中均低表达(均P<0.05)。在高表达LTBP4的DiFi细胞株中转染小干扰si-LTBP4,敲低LTBP4,转染后72 h后进行transwell迁移实验发现,肿瘤细胞迁移能力增强(P<0.01);而在低表达LTBP4的HCT15细胞株中过表达LTBP4,72 h后肿瘤细胞迁移能力减弱(P<0.01)。裸鼠肺转移模型在通过尾静脉注射稳转细胞株shLTBP4以及shNC 5周后进行小动物活体荧光成像发现,敲减LTBP4后,小鼠肺部荧光信号增强(P<0.01)。高通量转录组测序发现,在DiFi细胞株中敲减LTBP4使细胞骨架蛋白TPM4的表达量增加(P<0.01),维持细胞运动功能(如肌动蛋白丝束收缩、应力纤维改变和肌动蛋束的调节)相关通路显著富集(均P<0.05)以及细胞形态改变相关通路(如轴突伸展调节、突触前膜、核孔和活性离子跨膜传输等)显著富集(均P<0.05)。Western blot、qPCR及免疫荧光实验验证DiFi细胞株中敲减LTBP4促进细胞运动相关蛋白TPM4的表达(均P<0.01)。结论 LTBP4可以通过调控TPM4的方式抑制侵袭性伪足的形成从而遏制结直肠肿瘤细胞的转移。

pH荧光分子探针与人血清白蛋白之间相互作用的研究

在模拟生理条件下,用光谱法研究了pH荧光探针WZK-33与人血清白蛋白(HSA)的相互作用机制。由光谱谱图结果可以得出,此探针可以猝灭HSA的荧光,探针与HSA之间的猝灭机制主要是静态猝灭方式。由热力学数据确定了二者之间的作用力类型为范德华力和氢键,结合位点为一个。二者之间的结合距离为4.77 nm。同步荧光、三维荧光光谱以及CD光谱表明探针改变了HSA的构象。

过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白腺病毒载体的构建

目的构建一种特异性标记过氧化物酶体的GFP腺病毒载体。方法设计含过氧化物酶体信号肽的GFP序列,PCR法扩增该序列片段,并将其与腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack连接,然后将连接产物转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中获得重组质粒并测序鉴定。重组质粒经限制性内切酶PmeⅠ酶切线性化后,转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞中进行同源重组。重组腺病毒质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后感染293A细胞,进行病毒包装,得到含过氧化物酶体信号肽的Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒。用腺病毒Ad-GFP-Peroxi和不含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP感染培养的大鼠心肌细胞H9C2,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光强弱。将用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染的H9C2细胞分为正常培养组和1%O2浓度培养组,培养24 h后于共聚焦显微镜下观察,并进行荧光信号聚集情况分析。结果含过氧化物酶体信号肽的GFP腺病毒载体构建成功。与不含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP相比,含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP-Peroxi能够特异性显示大鼠心肌细胞H9C2内过氧化物酶体的分布,且缺氧培养的H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象。结论利用同源重组方法成功构建了过氧化物酶体特异性GFP腺病毒,其对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率,共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况。

绿色荧光蛋白-去整合素融合蛋白的表达及其结合功能的研究

目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)-去整合素(disintegrin)融合基因,表达并分析该重组蛋白的生物学活性。方法:利用HF-PCR扩增Ⅱ型蛇毒出血性金属蛋白酶agacutin基因的去整合素区,并与绿色荧光蛋白基因进行拼接;将GFP-去整合素融合基因克隆入表达载体pQE-30,IPTG诱导重组蛋白表达;流式细胞术(FCM)与荧光显微镜分析重组蛋白与细胞的结合能力。结果:GFP-去整合素融合蛋白的表达载体在大肠杆菌M15中得到有效表达,菌体呈绿色。表达的蛋白量占菌体总蛋白的38%左右,免疫印迹证实分子量约为39 kD;FCM分析显示该重组蛋白可与表达整合素的乳腺癌细胞MDA-MB-231和内皮细胞EA.hy926特异结合,在荧光显微镜下可见与重组蛋白结合的细胞发出绿色荧光。结论:GFP-去整合素融合蛋白可与表达整合素的细胞结合,并保留了各自的生物学活性,可用作肿瘤与血管生成等研究的新的分子标记物。

基于COL1A1启动子和增强型绿色荧光蛋白基因建立人肝星状细胞活化的细胞模型

目的:建立评价人肝星状细胞中Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1肽链(collagen Iα1 chain,COL1A1)基因启动子活性的可视化报告系统,判断细胞的活化状态,为抗肝纤维化药物的研究提供细胞模型。方法:以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,扩增COL1A1启动子序列。在pLVX-AcGFP1-N1质粒基础上构建以COL1A1启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达的重组质粒pLVX-COL1A1-EGFP。使用慢病毒包装系统将pLVX-COL1A1-EGFP稳定转染至永生化的人肝星状细胞LX-2中,并筛选单克隆细胞株。对该细胞株使用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)激活及2种具有潜在抗肝纤维化作用的药物处理。使用荧光显微镜及ImageJ 1.49软件对细胞中EGFP荧光强度进行半定量分析,再分别使用逆转录实时定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫印迹试验检测胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平。结果:构建了由COL1A1启动子调控EGFP表达的重组慢病毒质粒pLVX-COL1A1-EGFP,并加入了Kozak序列以增强EGFP的表达,获得了稳定转染pLVX-COL1A1-EGFP的LX-2单克隆细胞株LX-2-CE。LX-2-CE经过TGF-β1和具有潜在抗肝纤维化作用的5μmol/L二氢丹参酮Ⅰ共处理24 h后,其总荧光强度和平均荧光强度均低于TGF-β1单处理组(P<0.05);胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平同样均低于TGF-β1单处理组(P<0.05)。结论:成功构建了基于COL1A1启动子调控EGFP表达的肝星状细胞活化的报告系统,可在体外直观报告肝星状细胞活化相关标志物COL1A1表达,为抗肝纤维化药物的筛选和研究提供了新的细胞模型。

氢键对绿色荧光蛋白发色团类似物双光子吸收特性的影响

本文采用分子动力学模拟和量子化学计算相结合的方法,研究了氢键对一种新型供体-受体型绿色荧光蛋白发色团类似物的双光子吸收性质的影响从分子动力学模拟中提取了氢键复合物的可能构型,并利用二次响应理论方法计算了发色团及其各种氢键复合物的双光子吸收性质,建立了氢键结构与双光子吸收性质之间的关系.结果表明,发色团与溶剂水分子可以通过O…H-O,N-H…O和NH-O三种类型氢键相结合.O…H-O键的形成导致吸收波长发生红移,双光子吸收截面在一定程度上减小.N…HO键可以在较长波长处显著增强双光子吸收,而N…H-O键会使吸收波长蓝移,并显著降低双光子吸收截面。应用两态模型,解释了氢键效应产生的原因,并绘制了相关分子轨道,分析了电荷转移特性,此外,通过统计各种氢键复合物的几率,获得了平均双光子吸收谱.本研究为利用氢键网络设计双光子吸收材料提供了良好的理论指导.

绿色荧光蛋白-荧光素酶标记的人源化非小细胞肺癌原位动物模型建立方法

目的采用绿色荧光蛋白-荧光素酶(GL)标记的人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞建立人源化NSCLC原位动物模型。方法制备GL逆转录病毒液。将上述病毒液转染至处于对数生长期的人类NSCLC细胞株(H460细胞)后进行流式分选,从而构建稳定的GL阳性H460细胞(H460-GL细胞)。将15只Nod-Scid小鼠随机分为低剂量组(n=5)、中剂量组(n=5)、高剂量组(n=5),分别以H460-GL细胞1.0×10^(4)个/20μL、1.0×10^(6)个/20μL、1.0×10^(8)个/20μL的密度进行小鼠肺组织原位注射。实验期间观察各组小鼠的一般情况及存活情况。每周通过荧光活体成像观察各组小鼠体内肿瘤的成活、生长情况。造模后第35天处死成瘤小鼠,取肺组织进行病理组织学观察。结果(1)大部分小鼠出现呼吸系统肿瘤相关症状;濒死期小鼠胸腔内均出现不规则形状的白色肿瘤组织,且其与周围肺组织及心脏粘连严重。(2)造模后第22天开始各组小鼠逐渐死亡,于造模后第35天低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠的存活率分别为80%(4/5)、20%(1/5)、0。(3)在低剂量组中,于造模后第14天仅有1只小鼠出现H460-GL细胞荧光,造模第28天的成瘤率为60%(3/5),且成瘤小鼠体内的荧光强度大小不一;在中剂量组、高剂量组中,所有小鼠在造模后第7天均出现H460-GL细胞荧光,且荧光均逐渐增强,在造模后第14天、第21天成瘤小鼠体内的荧光强度相似且较为均匀。结论该造模方法可获得稳定的人源化NSCLC原位动物模型,且操作简便、易于复制,可在动物体内模拟人类NSCLC发生、发展、转移过程,并能实时观察肿瘤大小与转移路径。

利用绿色荧光蛋白标记产肠毒素大肠杆菌F4ac

利用电击转化法将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的原核表达载体pTurboGFP-B转化到产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F4ac中,获得表达绿色荧光的菌株ETEC F4ac-GFP。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结果显示,转化菌株表达绿色荧光蛋白编码基因,且可以在蓝光仪和荧光显微镜下清晰地观察到转化菌株发出绿色荧光;将ETEC F4ac-GFP与IPEC-J2细胞系进行体外粘附试验,在细胞水平验证了转化菌株荧光表达的稳定性与可靠性,且ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的胞粘附能力。CCK-8(Cell Counting Kit-8)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的毒力。本研究为深入探究ETEC F4ac致病机理提供了工具菌株。

斑马鱼Mylz2启动子的克隆与转绿色荧光蛋白基因鱼的构建

为获得能在肌肉表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼(Brachydaniorerio),采用PCR方法,从斑马鱼基因组DNA中分离了肌球蛋白轻链2启动子,序列分析表明,该启动子与国外文献报道的斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子序列的相似性为98.6%。将改造后的启动子插入绿色荧光蛋白基因载体,构建成肌肉特异性表达载体。通过显微注射,将线性化的表达载体注入斑马鱼的受精卵,获得了转绿色荧光蛋白基因的斑马鱼。绿色荧光蛋白在胚胎期开始表达,随着鱼体的生长表达量有增加的趋势,成鱼在紫外灯下用肉眼即可观察到绿色荧光。转基因鱼绿色荧光蛋白的表达具有明显的肌肉特异性。本研究为下一步特定基因的表达研究和获得有特色的转基因观赏鱼奠定了基础。