利用工程化绿色荧光蛋白传递蛋白质类药物进入生物学禁区

美国哈佛大学霍华德·休斯医学研究所的科学家报道发现一种新方法，帮助诸如新一代以蛋白质为基础的药物越过生化屏障。

绿色荧光蛋白作为骨髓间充质干细胞示踪标记物在脑出血脑内的表达

目的探讨利用绿色荧光蛋白(GFP)作为骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑出血示踪标记物的可行性。方法利用GFP空载体重组腺病毒感染BMSCs,应用脑立体定位仪将感染的BMSCs移植入脑出血大鼠纹状体内,移植后5、14 d,脑组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察BMSCs在脑组织内分布的表达。结果感染细胞与未感染细胞体外培养形态无差异,感染细胞及其传代细胞发强绿色荧光。荧光显微镜下观察脑出血模型冰冻切片,移植后各时间点在移植部位周围病灶区内有大量发绿色荧光的细胞。结论 GFP感染BMSCs能在脑出血大鼠脑内稳定持久表达,表明GFP是脑出血干细胞移植治疗的有效示踪标记物,为进一步研究移植细胞在宿主脑内的可塑性研究奠定基础。

增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体构建及其在移植干细胞示踪和定量中的初步应用

目的:构建增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体,并观察其在移植真皮多能干细胞示踪和定量中的应用。方法:实验于2004-08/2005-10在解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成。①细菌内同源重组构建含增强型绿色荧光蛋白基因的骨架质粒,PacⅠ酶切后转染293细胞,包装出增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体。增强型绿色荧光蛋白腺病毒表达载体鉴定正确后,收集293细胞反复冻融离心收集上清,粗制病毒液感染293细胞,扩增重组病毒载体。②选取新生1d雄性大鼠1只作为供体,剪取皮肤进行真皮多能干细胞的分离培养鉴定。将第7代粗制病毒液加入生长状态良好的真皮多能干细胞,转染后5d观察绿色荧光蛋白阳性细胞数量,计数绿色荧光蛋白阳性细胞百分比。③选取60只成年Wistar大鼠作为受体,随机分为全身照射组和正常对照组,各30只。全身照射组大鼠接受总剂量为5Gy的γ射线照射,正常对照组不接受放射。两组大鼠均接受尾静脉移植的1mL增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体转染的真皮多能干细胞悬液。两组分别于照射后5d,1,2,3,4周荧光显微镜下观察真皮多能干细胞在骨髓组织中的分布情况,每个时相点6只大鼠;同时定量分析骨髓中真皮多能干细胞的含量。结果:作为受体的60只大鼠全部进入结果分析。成功地构建了增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体,并发现其可转染和标记真皮多能干细胞。增强型绿色荧光蛋白标记的真皮多能干细胞在移植后4周内在大鼠体内的分布可被有效地检测,荧光激活细胞分类结果显示全身照射组大鼠骨髓中真皮多能干细胞的含量从移植后5d～4周均明显高于正常对照组大鼠(P<0.01)。结论:增强型绿色荧光蛋白腺病毒载体可有效地标记真皮多能干细胞,并能很好地示踪和定量分析移植到大鼠体内真皮多能干细胞的分布情况。

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的：探讨血清1型腺相关病毒（rAAV1）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白（GFP）的表达及转染率。方法：采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒（rAAV1-EGFP）感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型，用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h，再用此缝线间断缝合，将植片移植到大鼠角膜植床，术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果：按rAAV1-EGFP不同转染倍数（MOI）转染角膜基质细胞。转染后3d，在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达；随MOI值的增高而增强，转染再7～9d达到高峰，此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率，MOI=10^时是16．3％，MOI=10^4时是30．3％，MOI=10^5时是43．6％，MOI=10^6时是47．5％.rAA1－ECFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论：rAAV1-ECFP可以在体内外稳定、有转染大鼠角膜基质细胞，是角膜基质细胞理想的报告基因。

绿色荧光蛋白转基因胚胎大鼠神经干细胞生物学特性研究

目的:体外分离、培养、鉴定绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因胚胎大鼠神经干细胞,研究其体外活性与生物学性状,为在体分化示踪研究奠定基础。方法:采用机械分离,无血清传代培养法从GFP胚胎大鼠海马获得神经干细胞,免疫荧光和免疫细胞化学法染色进行体外神经干细胞性质和分化活性鉴定,并利用流式细胞计数法行纯度检测。结果:成功从GFP胎鼠海马获得神经干细胞,体外生长情况与活性良好,能分化成神经元和胶质细胞;体外连续传代3次后绝大部分细胞Nestin表达阳性,且分化后细胞的GFP表达不受影响。结论:GFP胚胎大鼠来源神经干细胞具有普通胎鼠神经干细胞相同的自我更新和多向分化潜能,且能稳定表达GFP,因此它可以成为示踪神经干细胞研究的有效工具细胞。

非病毒载体负载增强型绿色荧光蛋白转染永生化神经前体细胞

目的:寻找能高效转染永生化神经前体细胞(IN-PC)的非病毒载体,观察转染后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.方法:用阳离子脂质体Lipofectamine 2000,TRANS-fection或阳离子聚合物Sofast分别负载质粒EGFP-C1转染INPC,利用荧光显微镜检测转染后24h的转染效率.对转染效率最高的一种载体,观察其转染后12,24,48和72h转染效率,确定EGFP表达最高峰.用台盼蓝排斥试验检测转染和未转染细胞的活力.质粒EGFP-C1转染INPC后,经G418筛选,挑选细胞克隆,命名为INPC/EGFP,观察其EGFP阳性率.应用巢蛋白抗体鉴定INPC/EGFP.50mL/L胎牛血清诱导IN-PC/EGFP分化,观察分化后细胞的形态及EGFP表达.结果:Lipofectamine 2000,TRANSfection和Sofast转染INPC后24h,转染效率分别为(25.5±2.9)%,(4.0±1.7)%,(7.9±1.4)%.Lipofectamine 2000的转染效率最高.其转染后12,24,48和72h的转染效率分别为(17.1±0.7)%,(25.5±2.9)%,(19.4±0.9)%,(15.6±1.4)%,EGFP在转染后24h表达最高.INPC/EGFP中,EGFP阳性率约为95%.INPC/EGFP巢蛋白表达阳性,其分化后呈神经元或星形胶质细胞样,且胞体及突起中仍可见绿色荧光.结论:Lipofectamine2000可高效转染INPC.EGFP是INPC理想的示踪方法之一.

Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究

目的:表达具有双功能特性的Exendin-4-GFP融合蛋白。方法:构建融合表达载体pET21a(+)/Exendin-4-GFP,转化大肠杆菌BL21后,以IPTG诱导融合蛋白的表达,并利用镍金属螯合层析树脂对其进行纯化。采用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)转染的CHO细胞考察融合蛋白的结合特性,并检测其生物活性。结果:含有融合表达载体的重组菌株诱导表达后,经SDS-PAGE及免疫印迹分析显示,31.0ku的融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,且具有Exendin-4的抗原活性。受体结合实验表明,该融合蛋白能够与GLP-1R特异性结合,在488nm激发光下呈现绿色荧光。体内活性实验表明,融合蛋白具有明显的降血糖活性。结论:本研究表达的Exendin-4-GFP融合蛋白同时具有Exendin-4的活性和荧光特性,为研究GLP-1受体功能以及Exendin-4与细胞相互作用的机制奠定了基础。

绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用

目的:了解绿色荧光蛋白标记在干细胞移植研究中应用的进展情况。资料来源:应用计算机检索Medline1990-01/2005-11期间的相关文章,检索词为“greenfluorescentprotein,stemcell,labeling”,并限定文章语言种类为English。同时计算机检索重庆维普数据库、清华同方数据库和万方数据库1990-01/2005-11期间的相关文章,检索词为“绿色荧光蛋白,干细胞,标记”,并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与绿色荧光蛋白标记在干细胞移植中的应用研究相关。排除标准:明显缺乏随机对照的实验研究、重复研究或综述类文献。资料提炼:共收集到123篇相关文献,27篇文献符合纳入标准,排除的96篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的27篇文献中,关于绿色荧光蛋白的结构和功能7篇,关于绿色荧光蛋白标记干细胞的方式及其在干细胞分化、定量、示踪中的应用17篇,关于绿色荧光蛋白在细胞标记的毒副作用3篇。资料综合:绿色荧光蛋白作为标记物时主要优点有:①不需加任何底物,监测方便。②分子量较小,与目的基因融合后,对目的基因的结构功能影响小。③不影响或很少影响细胞的正常功能。④绿色荧光蛋白荧光表达稳定,可耐受一定的理化处理。绿色荧光蛋白被广泛地应用于干细胞移植的研究中。目前,常用的标记干细胞的方式有3种:质粒载体转染、病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物。结合使用定量聚合酶链反应、激光共聚焦、荧光激活细胞分类计数和激光捕获显微切割技术等技术方法,可有效地监测移植干细胞在体内的分布和分化情况,并可定量分析其在组织中的含量。结论:绿色荧光蛋白标记具有检测方便、表达稳定和不影响细胞功能等优点,从而被广泛地用于示踪移植干细胞在体内的分布、含量、分化等方面的研究。绿色荧光蛋白标记细胞还可能存在一定的毒副作用,应进一步加以改进,以利于其应用。

绿色荧光蛋白和胰岛素基因共表达重组腺病毒载体的构建及感染人脐带间充质干细胞的实验研究

目的构建同时表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin,INS)基因的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-INS,并感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs),观察其表达及诱导hUCMSCs成脂分化的作用。方法用EcoRI/XhoI将胰岛素基因从原始质粒上切下,定向插入至pShuttle-CMV-EGFP穿梭质粒,将验证正确的pShuttle-CMV-EGFP-INS中的EGFP-INS片段转移至pAdxsi载体上,构建pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒载体,用PacI限制性内切酶线性化后转染人胚肾细胞系HEK293细胞,扩增纯化重组腺病毒,测定病毒滴度。原代培养hUCMSCs,分别用pAdxsi-EGFP-INS(感染组)及pAdxsi-EGFP(对照组)腺病毒感染hUCMSCs,观察荧光蛋白的表达情况,成脂诱导剂诱导分化,油红O染色观察胰岛素对hUCMSCs成脂的诱导作用。结果成功构建pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒载体,包装、纯化后获得滴度达4×1011pfu/ml的重组腺病毒。分离获得hUCMSCs并传代、纯化,pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs后,EGFP-INS在胞浆及胞核表达;成脂诱导培养18 d后,感染组细胞呈现出含有大量小脂滴的脂肪样细胞,而对照组细胞含有少量较大的脂滴,感染组含脂滴的脂肪样细胞数量多于对照组。结论获得的pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒可高效感染hUCMSCs,为进一步研究胰岛素在干细胞成脂诱导分化中的作用,追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具。

含绿色荧光蛋白基因的子宫内膜异位症体外模型的建立

目的由腺病毒介导绿色荧光蛋白基因转染子宫内膜细胞,构建子宫内膜异位症体外模型。方法取5例正常子宫内膜组织,分离子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,进行形态学观察和免疫荧光鉴定。用携带有绿色荧光蛋白基因的腺病毒转染细胞,比较转染后12、18、36、42h细胞的绿色荧光蛋白表达阳性率和凋亡率的差异。结果分离培养获得高纯度的子宫内膜腺上皮细胞(90%)和基质细胞(接近100%)。两种细胞均表达绿色荧光;与腺上皮细胞比较,基质细胞转染率明显增高(F=8.362,P=0.020),凋亡率明显降低(F=46.119,P<0.001);转染对细胞的凋亡率无明显影响(F=4.208,P=0.057)。结论利用腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因载体转染子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,可获得相对稳定的体外荧光子宫内膜异位症模型。

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞在急性脊髓损伤大鼠中的迁移和分化

目的观察绿色荧光蛋白转基因大鼠来源的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)在急性脊髓损伤大鼠脊髓组织中的迁移和分化情况。方法全骨髓贴壁培养法培养BMSCs,Allen法制作脊髓损伤大鼠模型,共30只大鼠。于造模1周后进行干预,随机选取造模成功的24只大鼠并随机分为脊髓损伤组、假移植组(生理盐水注射)和细胞移植组(BMSCs注射),每组8只。于移植前、移植后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d及42 d进行BBB(Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale)评分。HE染色、免疫荧光观察脊髓损伤的组织修复和BMSCs的迁移分化情况。结果从第14天始,细胞移植组大鼠的BBB评分较脊髓损伤组和假移植组大鼠高,差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色显示细胞移植组大鼠的脊髓结构相对完整,液化和囊泡区缩小,炎性细胞减少。免疫荧光显示BMSCs聚集于脊髓损伤处,且能分化为神经元、神经胶质细胞和神经前体细胞。结论 BMSCs能向脊髓损伤部位迁移和聚集,并分化为相应的神经细胞促进脊髓功能恢复。

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)标记的人脂联素(Adiponectin)真核表达质粒。方法:用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18-T/Adiponectin为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段,将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO上,转化入TOP10感受态细胞中,通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin。结果:PCR获得长度为736bp的目的片段,经pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后,证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列(AccessionNM-004797)100%匹配。结论:绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。

腺相关病毒-2介导增强型绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的实验研究

目的探讨血清2型腺相关病毒(rAAV2)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染神经干细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达规律及转染对神经干细胞生物学特性的影响。方法应用荧光显微镜观察转染神经干细胞的绿色荧光蛋白表达情况。传代后第10天,比较转染组和对照组子代细胞形成的神经球数;分化后第14天行免疫组织化学检查,比较转染组和对照组神经元和胶质细胞的比例。结果转染后第3天,可观察到神经球发出绿色荧光,强度逐渐增强,并在第9天达到稳定状态(90%的神经球发出强弱不等的荧光)。传代后第10天,转染组子代细胞每井形成的神经球数为(17.83±1.35)个,与对照组比较无显著性差别(P>0.05)。分化后第14天,转染组神经元、胶质细胞的胞体与纤细突起均可见绿色荧光,转染组神经元与胶质细胞比例分别为35.3%±3.1%和55.4%±7.3%,与对照组比较无显著性差别(P>0.05)。结论rAAV2-EGFP可以稳定、高效转染神经干细胞,且不影响神经干细胞的生物学特性,是神经干细胞理想的基因标记方法。

腺病毒介导绿色荧光蛋白转染神经干细胞的实验研究

目的:研究复制缺陷型腺病毒(replication deficient adenoviral vectors,AdVec)介导外源基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)感染体外培养的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)表达的可行性及感染效率,探讨EGFP作为NSCs示踪剂的可行性。方法:体外原代培养、扩增大鼠NSCs,扩增、纯化AdVec-EGFP病毒液,以AdVec-EGFP病毒液感染NSCs,荧光显微镜观察AdVec-EGFP在NSCs中的表达和转染效率,免疫细胞化学鉴定重组子。结果:EGFP报告基因AdVec-EGFP高效感染NSCs,转染后6 h荧光蛋白开始表达,48 h后达高峰,感染率为(76±2)%,且NSCs的生物学性状没有发生变化。结论:AdVec-EGFP具有较高的介导外源基因表达于NSCs的效率,是NSCs体内、体外研究较理想的示踪剂。

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在椎间盘髓核细胞中的表达

目的本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒,并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)基因导入慢病毒载体质粒pLenti6/V5 TOPO,应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒、包膜蛋白质粒等)共转染入293细胞进行包装,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72 h收集病毒上清并感染髓核细胞,在荧光显微镜下感染情况。结果重组慢病毒滴度测定约为107U/mL。感染人椎间盘髓核细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了含GFP的慢病毒载体,且能成功将目的基因转入椎间盘髓核细胞并表达。

增强型绿色荧光蛋白在体外培养的牛眼小梁细胞中的表达

目的观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescence protein,EGFP)在体外培养的牛眼小梁细胞(bovinetrabecular meshwork cells,BTMCs)中的表达。方法将含有pEGFP-C1的菌株复苏,抽提pEGFP-C1并进行鉴定。选用阳离子脂质体Lipofectamine包埋pEGFP-C1转染BTMCs,以荧光显微镜观察转染后细胞EGFP的表达情况。结果pEGFP-C1能有效地转染BTMCs,BTMCs可以很好地表达EGFP。结论外源性的EGFP能够在体外培养的BTMCs中有效地复制、转录和翻译。这种标记方法有利于从基因水平研究牛眼小梁细胞。

含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2表达载体的构建

目的:骨形态发生蛋白2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一。实验拟构建绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP2)真核表达载体,为在真核细胞的高效表达和基因治疗打下基础。方法:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室完成。①实验材料:含完整人骨形态发生蛋白2基因片段的pcDNA3.1/CT-hBMP2质粒由李曦铭博士惠赠;双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS(Invivogen公司),Zeo(Invivogen公司);pTA2?-T Easy(鼎国生物技术有限公司)。②实验过程及评估:以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用聚合酶链反应方法亚克隆出人骨形态发生蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定。结果:①聚合酶链反应获得长度约1216bp的目的片段,与预期片段相符。②经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的骨形态发生蛋白2cDNA序列(NM-001200)100%匹配。结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2真核表达载体。

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染血管内皮祖细胞的实验研究

目的探讨HIV-1来源的慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(GFP)基因转染血管内皮祖细胞(EPCs)的可行性和方法。方法用梯度密度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养。用细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测其表达情况。以HIV-1来源的慢病毒为载体、以GFP基因为目的基因转染EPCs,MTT法检测不同病毒滴度(MOI)时细胞增殖情况并观察转染率。结果单个核细胞经EGM-2培养基培养1周后即分化成EPCs。GFP转染后48 h细胞即发出绿色荧光。MOI 1∶10转染组细胞转染率低于MOI 1∶50组(P<0.05)。MOI 1∶50转染后的细胞与未转染GFP组比较,生长曲线无明显差异(P>0.05)。MOI 1∶100组转染后细胞的增殖处于停滞状态。结论采用HIV-1来源的慢病毒载体介导GFP基因转染标记EPCs是可行的。以MOI 1∶50进行转染对细胞生长影响小,转染效率高。

增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与轮状病毒(RV)VP6基因融合表达载体,研究融合蛋白表达及在细胞中的分布。方法提取A组人RVTB-Chen株VP6基因,用PCR扩增VP6编码cDNA片段。将此基因片段与真核表达载体pEGFP-C1携带的EGFP融合;运用脂质体的方法 ,将获得的重组质粒转染到MA104细胞中,在荧光显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的分布情况。结果成功构建了融合表达质粒;转染细胞后,融合蛋白可在MA104细胞中表达且主要分布在胞质中。结论 RVVP6可与EGFP融合表达,融合蛋白在细胞质中呈均匀的分布,与RV感染细胞中合成的VP6蛋白的分布有较大的差别。

融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白表达及对血迷路屏障作用

目的表达并纯化融合蛋白GST-反式转录激活因子蛋白-增强型绿色荧光蛋白(GST-transactivator of transcription-enhanced green f luorescence protein,GSTTAT-EGF P),并研究其是否能跨越血迷路屏障(blo o d labyrinth barrir,BLB)进入内耳。方法用基因重组技术将编码TAT蛋白11个氨基酸短肽基因和EGFP基因重组,分别构建p GEX-6p-1-TAT-EGFP和p GEX-6p-1-EGFP表达载体,将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,用GST树脂柱亲和层析纯化融合蛋白。将10只豚鼠随机分为两组,分别肌肉注射GST-EGFP和GST-TATEGFP;2~4 h后豚鼠经麻醉、断头取耳蜗等组织。用2%多聚甲醛固定,耳蜗经10%EDTA(p H7.4)脱钙、OCT包埋,制备颞骨冰冻切片,采用免疫组化技术和荧光显微镜技术观察TAT短肽是否可以携带分子量55 k D的GST-EGFP跨越BLB进入内耳。结果 GST-TAT-EGFP进入内耳后主要分布于血管纹和螺旋器,而对照组EGFP不能进入内耳。结论短肽TAT可转导大分子蛋白通过BLB进入内耳,为外源性蛋白药物治疗内耳疾病提供新手段。