短双链RNA对鸡胚盘细胞外源绿荧光蛋白基因表达的影响

RNA干扰 (RNAinterference,RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法 ,正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具。为了了解RNA干扰在禽类中的作用情况 ,实验将体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA (siGFP)和 3 磷酸甘油醛脱氢酶短双链干扰RNA (siGAPDH )分别同绿荧光蛋白(Greenfluorescentprotein ,GFP)表达载体 (pEGFP C1Vector)用脂质体转染试剂LipofectamineTM2 0 0 0共转染鸡胚盘细胞 ,并于转染后 36h在荧光显微镜下观察转染和干扰效果。对细胞绿荧光蛋白表达率的方差分析结果显示 ,不同处理组间差异达极显著水准 ,其中GFP组和GFP +siGAPDH组均同GFP +siGFP组差异极显著 ,GFP组同GFP +siGAPDH组差异不显著。实验结果说明 ,siGFP能特异、有效地敲低细胞绿荧光蛋白的表达。同线虫、真菌、拟南芥、水螅、锥虫、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等其它生物体一样 ,鸡胚盘细胞中也存在短双链干扰RNA (siRNA)

绿荧光蛋白标记人骨髓源性神经干细胞的体外实验研究

目的:探讨重组腺相关病毒包装绿荧光蛋白(rAAV-GFP)标记人骨髓源性神经干细胞(BM.NSCs)的可行性,为进一步行标记细胞移植实验研究奠定基础。方法:以成人自愿者的骨髓为研究对象,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞并用“Cytokine·神经干细胞培养基”诱导分化为神经干细胞,分化的细胞以免疫细胞化学鉴定。对接种生长的BM.NSCs(1×105～6/mL)以无血清培养基冲洗并重悬细胞,依最佳病毒感染指数(MOI)为105的标准计算、加入包装了GFP的rAAV病毒颗粒,连续培养12h(37℃,50mL/LCO2)以感染细胞;补加100g/L胎牛血清后,于神经干细胞培养基中继续细胞培养24h(37℃,50mL/LCO2)以上,荧光显微镜(OlympusIX70,Japan)追踪观察rAAV-GFP标记的BM.NSCs。结果:BM.NSCs于标记后1周内见不到GFP阳性表达;在标记10d后才出现有GFP阳性表达情况(平均每个200倍镜下视野可见到5～10个GFP阳性细胞),所标记的细胞在荧光显微镜下呈亮绿色;随着培养时间延长,BM.NSCs表达GFP也逐渐增强、阳性细胞数量逐渐增多,并可于1个月时最明显(标有GFP阳性的细胞可达BM.NSCs总数的60%),追踪观察到到2.5个月时亦未见衰减。结论:rAAV-GFP在人骨髓源性神经干细胞中的表达较迟,但呈渐强趋势;rAAV-GFP标记人骨髓源性神经干细胞具有可行性。

绿荧光蛋白基因在猪霍乱沙门氏菌C500株asd^-缺失株平衡致死载体系统中的表达

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱用于预防仔猪副伤寒病的弱毒疫苗株,毒力弱且免疫原性良好。为将猪霍乱沙门氏菌开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体并保持原有免疫原性,构建了以C500为亲本菌,用负向选择的重组自杀性质粒介导接合转移的方法构建了无抗性标记的asd-缺失株。首先构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失1408bp的带有蔗糖敏感基因sacB的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的asd-缺失株,通过PCR鉴定。该缺失株在无外源DAP(二氨基庚二酸)条件下溶菌死亡,它的生长必需外源DAP。PCR扩增绿荧光蛋白突变体4基因,克隆到带有asd基因的原核表达载体pYA3493中,电转化C500asd-缺失株,转化子在LB中生长,并激发强的绿荧光。上述结果表明,该asd-缺失株的构建是成功的,并且可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为开发C500为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

以绿荧光蛋白基因为报告基因的广宿主启动子探针载体的构建和应用

将以绿荧光蛋白基因（ ｇｆｐ） 的ｃＤＮＡ 为模板，用人工合成引物经ＰＣＲ 扩增获得的０－９ｋｂＤＮＡ 片段克隆到表达载体ｐＥＴ１１Ｃ 上构建成ｇｆｐ 表达载体ｐＨＮ１１５ 。从ｐＨＮ１１５ 上切下的不含启动子，但保留了ＳＤ 序列的ｇｆｐ 基因经克隆载体ＳＫ（ ＋ ） 和ｐＩＪ２９２５ 亚克隆后再克隆到广谱稳定性质粒ｐＴＲ１０２ 上构建成广谱、稳定、可视的启动子探针载体ｐＨＮ１２７ 。并用它从费氏中华根瘤菌ＨＮ０１ 的总ＤＮＡ 中成功地钓出组成型和诱导型表达的启动子。

表达绿荧光蛋白的多药耐药微小残留白血病细胞的小鼠模型

为了方便研究多药耐药微小残留白血病的病理生理和治疗,采用携带绿荧光蛋白(EGFP)基因标记的小鼠多药耐药白血病细胞系P388/VCRG和DBA小鼠建立一个检测多药耐药微小残留白血病的动物模型。结果显示,P388/VCRG细胞腹腔接种DBA小鼠,白血病的发病率为100%,无自发缓解。P388/VCRG白血病模型小鼠对环磷酰胺(Cy)敏感,有较好的药物剂量生存时间关系,接种细胞的对数与Cy剂量间有良好回归相关关系。白血病诱导缓解后残留白血病细胞在肝、脾、胸腺及骨髓等脏器呈不均匀分布。冰冻切片荧光显微镜下观察EGFP+细胞是检测小鼠体内微小残留白血病细胞最敏感的方法。结论:采用P388/VCRG细胞和DBA小鼠可建立表达EGFP的多药耐药小鼠微小残留白血病模型。

绿荧光蛋白的双光子激发的荧光特性研究

利用双光子激发方式研究了重组绿荧光蛋白 (recombinantgreenfluorescentprotein,简称rGFP)的光转换特性 ,研究结果表明rGFP具有较强的双光子激发荧光。双光子激发的荧光偏振光谱表明rGFP在辐照前质子态和去质子态之间存在着有效的能量转移过程。rGFP辐照后导致生色团构象的变化 ,部分阻断了rGFP内源的氨基酸与生色团之间的能量转移过程 ,导致rGFP的双光子激发的荧光强度下降。观察到rGFP的三光子激发的荧光特性 ,这种三光子激发的荧光主要来源于rGFP内源的氨基酸 (色氨酸 ,酪氨酸等 )的吸收。研究结果对在实际使用定量的荧光显微镜时具有一定的指导意义。

增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP在大肠杆菌中的表达与纯化

增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP(EGFP/V16 3A/S175G)是一种发光能力更强、更稳定的新型绿色荧光蛋白。为了获得大量高纯度的蛋白 ,将mut4EGFP基因插入原核表达载体 pTWIN1中 ,使之与几丁质结合域 (CBD) 内含肽 (intein)融合 ,获得原核表达质粒 pTWIN M 4。将 pTWIN M 4转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS ,IPTG诱导后进行SDS PAGE电泳分析 ,结果显示 ,CBD intein mut4EGFP融合蛋白在BL2 1(DE3) plysS中获得高效表达并以可溶性蛋白的形式存在。进一步采用几丁质柱纯化系统对表达产物进行纯化 ,得到了高纯度的mut4EGFP。

绿荧光蛋白及其在转基因动物研究中的应用

绿荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）是源于水母（Ｊｅｌｙｆｉｓｈ）、海笔（ＳｅａＰｅｎ，ＳｅａＰａｎｓｙ）等海洋无脊椎动物的一种蛋白质，这种蛋白质在体外经适当波长的光激发便可发出绿光，所发出的绿光用普通荧光显微镜或荧光激活细胞分拣器（ＦＡＣＳ）均可检测到。ＧＦＰ作为动、植物以及微生物基因工程研究上的一种选择标记具有检测灵敏度高，操作简便，对机体毒副作用小且不需要添加任何底物或辅助因子等优点，更重要的是检测ＧＦＰ无损于细胞或胚胎的完整性及活力。本文概括介绍ＧＦＰ的生化、发光光谱及遗传学特征及其在转基因动物研究上的应用。

绿荧光蛋白(GFP)研究进展

Ｇ Ｆ Ｐ作为一种全新的标记基因，在生物学的各研究领域得到了广泛的应用。本文概述了近年来来相关方面的研究进展和重要应用，以及尚存在的不足。

绿荧光蛋白的荧光强度在D-氨基酸氧化酶活性检测中的应用

目的 :探讨在转基因细胞KDfGc和KDfGd,以内部核糖体进入位点 (IRES)序列连接的绿荧光蛋白 (GFP)的荧光强度为单位 ,衡量D 氨基酸氧化酶 (DAAO)活性的准确性。 方法 :白血病细胞系K5 62e经转染含IRES序列连接的GFP和DAAO基因的逆转录病毒载体pLDfG ,获得稳定表达GFP和DAAO基因的单克隆细胞KDfGc和KDfGd,以流式细胞仪和Lowry测定其荧光阳性率以及平均荧光强度、蛋白量 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。 结果 :KDfGc和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .64%和 96.3 1%。 2× 10 4细胞的平均荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。 2× 10 4细胞的蛋白量分别为 13 .17μg和 7.12 μg ,KDfGc、KDfGd细胞每微克蛋白量每小时产生的H2 O2 峰值无差异 ,而以单位荧光来衡量 ,两细胞具有明显差别。 结论 :在含IRES序列的转基因细胞 ,以GFP的平均荧光强度为度量单位 ,比以细胞蛋白量能更准确地反映DAAO的活性。

制备两种p53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达

背景与目的p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺病毒,并采用流式细胞仪散点图(flow cytometry scatter plot,FCM)检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达。方法利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种p53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒,测序证明。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM scatter plot检测其GFP表达。结果测序证明重组腺病毒:Ad-p53(del)缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad-p53(wtp)无p53碱基缺失。Ad-(empty carrier)无p53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端p53和全长p53的两种重组腺病毒:Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)及空载体Ad-(empty carrier)。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。

绿荧光蛋白作为表达标记在分枝杆菌中的研究应用

绿荧光蛋白(GFP)基因是近年来被分离克隆,并作为表达标记的一种新型报告基因,与其他报告基因相比,有其特有的优势。本文主要介绍GFP的特点,以及在研究分枝杆菌的分子生物学、致病相关性现象分析、药物筛选等方面的应用。

制备两种P53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达

目的P53作为转录因子在细胞应激时呈活化型，调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长，通常，通过各种机制P53呈非活化状态，其中包括P53C-末端负调控序列的作用。该研究目的是制备携带垒长和缺失这些负调控序列P53两种重组腺病毒和用流式细胞仪散点图（Flow cytometry scatter plot，FCM）检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）表达。材料和方法利用pAdEasy-Track载体系统，构建两种P53重组质粒并在细菌中产生重组体，转染L293细胞产生三种重组腺病毒。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞，FCM分析GFP表达。结果测序证明重组腺病毒：Ad—P53（del）缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区，Ad—P53（wtp）没有P53碱基缺失。Ad（empty carrier）无P53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端P53和全长p53两种重组腺病毒，Ad—p53（del），Ad-p53（wtp）及空载体Ad-（empty）。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠，可定量外源GFP表达，为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。

玉米丝黑穗病菌绿荧光蛋白标记菌株的构建与应用

玉米丝黑穗病病原菌为丝轴团散黑粉菌（Sporisorium reilianum）,属于担子菌亚门冬孢菌纲黑粉菌目真菌,其引起的玉米丝黑穗病是一种土传病害,在种子时期或经根系侵染寄主[1]。其侵染方式为系统性侵染,病害症状早期不明显,直到该菌株代替寄主植株的雄性或雌性花序时,才出现典型症状[2,3]。

建立表达增强型绿荧光蛋白的小鼠多药耐药白血病模型

目的建立增强型绿荧光蛋白(EGFP)基因标记的小鼠多药耐药白血病模型。方法以磷酸钙沉淀法将pLNG蛳EGFP质粒导入ΦNX蛳E包装细胞,用脂质体转染的方法获得高滴度的EGFP病毒,并转导入小鼠多药耐药白血病细胞;采用悬浮细胞培养观察该细胞的生长规律;流式细胞术分析细胞周期分布;RT蛳PCR方法检测mdr1a基因表达;体内接种观察白血病发病情况并比较其耐药性的变化。结果将pLNG蛳EGFP质粒导入ΦNX蛳E包装细胞后,收集细胞培养上清,病毒滴度为(4.5±3.4)×106CFU/mL。病毒转染后的小鼠多药耐药白血病细胞P388/VCR蛳G能稳定地表达绿色荧光。与P388/VCR细胞相比,P388/VCR蛳G细胞倍增时间、周期分析无明显差异;RT蛳PCR检测mdr1a基因的结果为:P388/S蛳G细胞阴性,P388/VCR蛳G细胞阳性。P388/VCR蛳G细胞在DBA小鼠体内也具有耐药性。所有接种P388/VCR蛳G细胞的DBA小鼠均死于腹水型白血病。结论建立了在体内稳定表达EGFP的小鼠多药耐药白血病模型,为研究多药耐药提供一种新的工具。

生长抑制因子1基因核定位序列绿荧光蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建p33ING1b核定位序列(nuclearlocatingsequence,NLS)绿荧光蛋白融合表达载体,将其转染到人胚肺纤维母细胞系MRC5,建立稳定表达该融合蛋白的细胞模型。方法应用逆转录PCR获得p33ING1b的NLS序列,然后将NLS序列插入绿荧光蛋白融合表达载体pEGFP C1的多克隆位点,构建pEGFP C1NLS绿荧光蛋白融合表达载体,再用此载体转染MRC5细胞系,观察活细胞绿荧光蛋白的亚细胞定位。结果成功构建了pEGFP C1NLS绿荧光蛋白融合表达载体,由该载体表达的绿荧光蛋白NLS肽段融合蛋白产生的绿色荧光信号全部定位于胞核部位,而空载体转染的细胞表达的绿色荧光蛋白,绿色荧光信号定位于细胞浆中。结论在活细胞内,生理情况下P33ING1b完全定位于细胞核,并且在其亚细胞定位的转运过程中,NLS肽段起着决定性作用。

绿荧光蛋白基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞复合聚丙交酯-乙交酯膜的形态学观察

目的 观察绿荧光蛋白（GFP）基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCa）与聚丙交酯-乙交酯（PLGA）膜材料复合培养,为后续种子细胞.基因-支架材料-神经营养因子复合方法构建组织工程化脊髓的可行性提供依据.方法 GFP的过表达慢病毒载体（lv-GFP）转染的rMSCs-GFP按8000个细胞/cm2与PLGA膜材料复合培养,以普通培养板上的rMSC-GFP作为对照;荧光显微镜下观察细胞的形态学特性,噻唑蓝法测定每天细胞的生长增殖情况;流式细胞仪测定PLGA膜材料上第3天rMSCs-GFP的细胞周期,用FTTC标记的抗体CD34、CD90和用PE标记的抗CD44、CD106、CD45、CD11b对在膜材料上培养的第3天rMSCs-GFP进行流式细胞鉴定.结果 rMSCs-GFP在PLGA膜上贴壁生长,绝大多数MSCs可见绿色荧光,为成纤维细胞样形态,散在分布,第3天时细胞增多,开始变为多角形,第7天时细胞基本铺满膜,多为多角形和短梭形,与普通培养板上细胞相似,细胞的生长增殖在PLGA膜上与培养板上大致相同,细胞周期也大致相同[G1期细胞占89.7%,132期细胞占3.3%,S期细胞占7.0%,差异无统计学意义（P〉0.05）],细胞在PLGA膜上高表达CDg0（99.48%）、CD44（95.25%）、CDl06（77.12%）.结论 骨髓间充质干细胞是脊髓组织工程适宜的种子细胞,重组GFP的过表达慢病毒感染的后的MSCs与PLGA膜材料具有良好的组织相容性,可进一步复合方法体外构建组织工程脊髓.

猪圆环病毒I型ORF2蛋白序列与其核定位功能的相关性

软件分析PCV1-ORF2的核苷酸序列发现其N端的氨基酸序列中包含一段核定位序列,将具有核定位序列特征的区域删除,构建缺失核定位序列的PCV1-ORF2基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,同时构建PCV1-ORF2全基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,分别转染Hela细胞,可观察到后者绿色荧光聚集在细胞核区域;而前者转染Hela细胞结果显示核定位现象消失,从而可以推断这一区域是CPV1-ORF2蛋白核定位的功能区。

乙肝病毒HBx基因荧光真核表达质粒的构建与鉴定

目的:克隆乙肝病毒HBx基因及构建增强型绿色荧光蛋白-HBx基因(pEGFP-N1-HBx)荧光真核表达质粒并进行表达鉴定。方法:以CH-HEP-1肝癌细胞株基因组DNA为模板PCR法扩增HBx基因,PCR产物测序分析正确后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,命名为pEGFP-N1-HBx。将该质粒转染肝细胞株HepG2以RT-PCR及荧光显微镜检测其表达情况。结果:酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含HBx基因,RT-PCR检测和荧光显微镜观察表明构建的pEGFP-N1-HBx在肝癌细胞株HepG2真核细胞中表达,且其绿色荧光蛋白瞬时表达率为20%～30%。结论:HBx基因克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-HBx构建成功,可用于肝癌发生发展的生物学研究。