绿豆过敏原多克隆抗体制备及间接竞争酶联免疫检测方法的建立

目的:建立绿豆过敏原间接竞争ELISA检测方法。方法:用碱溶酸沉的方法从绿豆中提取总蛋白,考马斯亮蓝G-250法定量蛋白,SDS-PAGE分析总蛋白的分子质量。采用总蛋白免疫新西兰大耳白兔,初次免疫采用弗氏完全佐剂乳化,免疫剂量为1 mg/只;分别在初免后第14、28、32和46天加强免疫,共4次,以弗氏不完全佐剂乳化,免疫剂量为0.5 mg/只。采用Protein A-Sepharose 4B亲和层析纯化抗血清。通过优化绿豆蛋白的包被量和抗体的稀释倍数,建立间接竞争酶联免疫检测方法。结果:经SDS-PAGE分析得到主要的绿豆蛋白分子质量为50、38、34和25 ku。免疫制备的抗绿豆过敏原多克隆抗体效价达到32 000。包被绿豆蛋白0.1μg/孔,抗体稀释1∶32 000,建立了间接竞争酶联免疫检测方法,灵敏度IC50=(0.72±0.035)μg/mL,检出限IC15=(0.72±0.035)μg/mL。结论:成功建立了绿豆过敏原间接竞争酶联免疫检测方法。