sacB介导的绿针假单胞菌YL-1遗传操作方法

绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis YL-1是从大豆根围分离获得的,对多种病原细菌和病原真菌有较强抑制作用。为了探明绿针假单胞菌YL-1生防相关基因的功能,本研究以嗜铁素转录调控因子PvdS编码基因为对象,建立了一套基于负选择标记基因sacB的绿针假单胞菌无标记基因敲除技术,构建重组质粒p EX18-pvdS,通过改良的细菌接合转移技术将重组质粒导入野生型菌株YL-1中,利用同源重组技术获得缺失突变株ΔpvdS。生防相关性状研究结果表明,与野生型菌株YL-1相比,突变株ΔpvdS泳动能力和生长能力未发生改变,但是群集运动能力显著下降。同时突变株ΔpvdS合成嗜铁素的能力也显著下降,pvdS基因互补后突变株能恢复合成嗜铁素的功能。本文结果表明,已成功建立了适用于YL-1的基因定向敲除技术和功能基因互补体系,为深入研究YL-1的生防机制奠定了重要基础。

绿针假单胞菌YL-1高产荧光性嗜铁素的摇瓶发酵工艺优化

绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)YL-1是一种对多种病原菌均有良好防治效果的生防菌株,前期研究结果表明,在室内缺铁培养基和自然环境中,绿针假单胞菌的主要抑菌物质是其分泌的荧光性嗜铁素(Pyoverdine,简称PVD)。为提高其嗜铁素的产量,采用摇瓶培养发酵,通过Plackett-Burman试验设计、中心组合(CCD)试验设计和响应曲面法,优化YL-1菌株高产嗜铁素的发酵培养基成分和发酵条件,最终获得YL-1菌株高产嗜铁素的最佳培养基成分为1.52 g/L丁二酸、2.00 g/L丁二酸钠、0.88 g/L MgSO_(4)·7H_(2)O、0.50 g/L(NH_(4))_(2)SO_(4)、0.50 g/L蔗糖、3.49 g/L KH_(2)PO_(4),5.44 g/L K_(2)HPO_(4),最佳培养条件:温度为26℃,pH值为7.0,发酵时间为36 h,接种量为2%,转速为180 r/min,装液量为250 mL三角瓶装50 mL液体。摇瓶试验结果表明,优化培养基成分及培养条件后,菌株YL-1嗜铁素的产量提高43.18%,D_(405 nm)/D_(600 nm)值为2.36,优化效果明显。

绿针假单胞菌YL-1抗细菌活性相关基因的克隆和分析

绿针假单胞菌YL-1对植物多种重要病原细菌和病原真菌有较强的抑制作用。采用转座子插入突变技术电转化绿针假单胞菌YL-1,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对3种病原细菌荚壳伯克霍尔德菌Burkholderia glumae、解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovora和胡萝卜果胶杆菌Pectobacterium carotovora抑菌效果显著下降的突变体,并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到YL-1染色体基因组上。利用质粒拯救技术克隆转座子插入位点基因、测序和生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了绿针假单胞菌YL-1随机插入突变体库,筛选出7株对3种病原细菌抑制效果明显下降的突变体,但其对立枯丝核菌的抑制效果与野生型菌株YL-1相同;PCR和Southern Blot试验结果表明绿针假单胞菌YL-1的7株突变体均是单拷贝;克隆到7个突变体插入位点的基因序列并测序,生物信息学分析结果表明其中6个突变位点是嗜铁素合成基因簇,1个突变位点是蛋白分泌基因sec Y。

发酵优化绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO高产吩嗪-1-羧酸

对绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO的发酵条件进行优化并在5 L反应器中进行放大培养。在摇瓶水平通过单因素实验、正交实验、最陡爬坡实验和中心组合设计实验,优化得到最佳培养基组成为甘油49.55 g/L、大豆蛋白胨37.34 g/L、KCl 1.5 g/L、MgSO_(4)0.75 g/L、K 2 HPO_(4)0.225 g/L,发酵60 h后吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)的最大产量为(6.01±0.17)g/L,是优化前的2.6倍。在1 L反应器中优化发酵pH,当培养过程pH值维持在6.8时,PCA的产量最高,为(7.16±0.04)g/L,是优化前的1.2倍。在最优培养基和pH条件下,对菌株在5 L反应器中进行放大培养,发酵60 h后PCA的最大产量为(6.84±0.53)g/L。研究为提高PCA的生物合成速率和工业化应用提供支持。

高产吩嗪-1-甲酰胺的绿针假单胞菌的诱变与基因工程育种

产量低是限制生物农药吩嗪-1-甲酰胺(Phenaizne-1-carboximade,PCN)推广应用的主要因素。本文综合使用诱变育种和基因工程改造来提高绿针假单胞菌的PCN产量。诱变育种使用亚硝基胍(NTG)和紫外线(UV)处理绿针假单胞菌HT66野生型菌株,以平板菌落表面的绿色PCN晶体量为指标建立高通量诱变筛选方法,通过10轮稳定可靠的诱变处理,获得的诱变高产株P3中PCN产量达到1 697mg/L,是野生菌株的3.99倍。在固体平板上培养时,P3菌株的菌落更大,PCN晶体更多且出现更早。在诱变育种的基础上进一步进行基因工程改造,敲除P3株中负调控PCN合成的rpeA基因,获得的P3ΔrpeA菌株PCN产量达到2 167mg/L,充分证明了2种育种方法结合使用的高效性。

绿针假单胞菌HT66中luxR_19对吩嗪-1-甲酰胺合成的影响

旨在研究调控基因lux R_19对绿针假单胞菌HT66中的抑菌物质吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,PCN)合成及菌体生长的影响,通过分子操作构建了lux R_19基因敲除株、回补菌株、过表达菌株以及lux R_19(G85A)点突变菌株,检测了目标菌株生长曲线、PCN发酵结果、细菌泳动性与从动性等。结果显示,将lux R_19敲除后PCN产量明显降低,对lux R_19基因进行过表达,发现能够将PCN产量提高2倍;lux R_19对于吩嗪合成的多个调控基因以及合成基因表达均产生影响;lux R_19的敲除对HT66的生长及泳动性不产生影响,而对细菌的从动性有一定的促进作用;lux R_19(G85A)点突变菌株吩嗪产量较野生型相差很小。结果表明,lux R_19对PCN的合成为正调控基因,一定程度上影响HT66的从动性,第254位碱基突变对PCN合成产量不产生影响。

假单胞菌属S10B9菌株对紫花苜蓿镰刀菌根腐病的生防作用

【目的】获得对紫花苜蓿镰刀菌根腐病具有防效的生防菌株。【方法】对分离自紫花苜蓿根际土壤、对苜蓿镰刀菌根腐病菌有拮抗能力的菌株S10B9进行生理生化鉴定及16S rDNA测序鉴定,并通过抑菌性试验及盆栽试验评价菌株S10B9对镰刀菌的抑制能力及对紫花苜蓿镰刀菌根腐病的盆栽防效。【结果】菌株S10B9经鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas spp.)。菌株S10B9对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)、层出镰刀菌(F.proliferatum)的菌丝生长均有抑制作用,其抑菌率分别为57.44%、53.68%、59.60%、57.00%。菌株S10B9无菌发酵液对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、轮枝镰刀菌、层出镰刀菌孢子萌发均具有抑制活性,抑制率分别为77.17%、48.79%、78.95%、76.01%。培养36、96 h的菌株S10B9无菌发酵液均能抑制4种镰刀菌菌丝生长。菌株S10B9能够降低腐皮镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病发病率,不影响紫花苜蓿正常生长,其盆栽防效为39.48%。【结论】菌株S10B9对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、轮枝镰刀菌、层出镰刀菌均有抑制作用,对紫花苜蓿镰刀菌根腐病具有良好盆栽防效。

绿针假单胞菌PL9菌株对烟草疫霉的拮抗作用研究

利用离体拮抗试验和烟草幼苗生物测定法研究了棉花根圈细菌绿针假单胞菌 (Pseudomonascholoraphis)PL9菌株对烟草黑胫病病原菌烟草疫霉 (Phytophthoraparasiticavar .nicotianae)的拮抗作用 ,该菌株对烟草疫霉菌丝体有很强的抑制作用 ,并且可以完全抑制烟草疫霉游动孢子对烟草幼苗的侵染 ,其液体培养物浓缩过滤液也有相同的抑制作用 ,拮抗作用机理研究结果表明 ,其拮抗作用可能与PL9菌株分泌的抗生素类物质有关。为了解PL9菌株在烟草根圈的定殖情况 ,采用全套发光酶基因 (luxCDABE)标记的菌株PL9L进行跟踪 ,结果表明该菌株可以在烟草根圈成功定殖。

gacS基因插入失活对绿针假单胞菌G-05的两种胞外次生代谢物合成的影响

一株来自大棚温室甜椒根际的绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis G-05,可分泌抗生物质吩嗪-1-羧酸,并具有抑制辣椒疫霉的生物防治功效。【目的】为了系统研究该菌株的生物防治功能及抗生物质合成与分泌机制。【方法】首先通过生化法和16S rDNA同源比对法对该菌株进行系统分类的初步鉴定,再根据基因的同源性从G-05基因组DNA中克隆长1.4 kb的gacS基因的部分保守区段,采用抗庆大霉素基因(gentamycin resistance cassette,aacC1)插入失活的策略构建了该基因突变株G-05S。【结果】在King's B(KMB)或PPM培养基中,突变株G-05S合成吩嗪-1-羧酸的能力受到明显抑制。然而,突变株G-05S分泌的吲哚乙酸与野生株相比无显著差异。互补实验表明,gacS基因的表达可以使突变株G-05S的吩嗪-1-羧酸的合成恢复到野生株水平。【结论】由此推测,GacS(Global activator sensor)对不同次生代谢物的调控具有特异性。

一株绿针假单胞菌桔黄亚种在防治番茄匍柄霉叶斑病中的应用

为筛选对番茄匍柄霉叶斑病具有良好拮抗效果的生防细菌,本研究采用稀释涂布法,从四川番茄根际土壤分离筛选到一株对番茄匍柄霉Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto具有显著抑制效果的生防菌株YS05。经过形态学特征观察、生理生化特征、Biolog测定和多基因系统发育树分析,鉴定其为绿针假单胞菌桔黄亚种Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca。生防机理初步研究发现,菌株YS05在代谢过程中可产生蛋白酶、氢氰酸、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxilic acid)和硝吡咯菌素(pyrrolnitrin),具有广谱拮抗作用,能够有效抑制9种病原真菌和3种病原细菌的生长。采用二分皿法测定其挥发性物质对7种病原菌均有抑制效果。离体叶片和活体盆栽条件下,接种菌株YS05的番茄发病率和病情指数均显著降低,离体叶片防效可达71.52%,活体盆栽防效可达61.27%。综上所述,菌株YS05具有良好的生防潜力和应用前景。

绿针假单胞菌泛基因组分析及次级代谢通路挖掘

为了对生防细菌绿针假单胞菌的基因组信息进行深入探索,全面描述绿针假单胞菌的特征并挖掘其次级代谢产物,从NCBI数据库中获得46个绿针假单胞菌的基因组,利用泛基因组分析软件和次级代谢产物挖掘软件对其进行分析。结果表明,46株菌的基因组大小在6.61~7.23 Mb,GC含量为62.0%~63.2%,共分为4个亚种,在进化树上被归为4个分支;泛基因组分析发现,其含有13296个基因家族,其中,核心基因家族有3653个,特有基因家族有3968个。次级代谢产物合成基因簇预测分析发现,46个绿针假单胞菌基因组中有27类、643个次级代谢基因簇,4个亚种中均含有的主要基因簇是高丝氨酸内酯、非核糖体肽合成酶、丁内酯、细菌素和吩嗪;且绿针假单胞菌中还有大量未开发的次级代谢产物。该研究明确了绿针假单胞菌的泛基因组和核心基因组特征,预测了其次级代谢产物,有助于全面了解绿针假单胞菌的特征及深入开发利用该菌株。

荧光假单胞菌M18 rpoD克隆及其对抗生素合成的影响

荧光假单胞菌M1 8对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomonesfluo rescens)M1 8能同时合成吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种抗生素。从M1 8的基因组中克隆了rpoD基因 ,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中RpoD蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌 荧光假单胞菌穿梭质粒pME60 32 ,将rpoD置于强启动子Ptac的控制下 ,导入M1 8菌株。发现经重组质粒转化的M1 8,与对照相比 ,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前 4h和 8h ,积累量提高 1倍和 6倍。

荧光假单胞菌M18的rpoS基因克隆及其功能分析

从荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescentsp .)M1 8基因组中克隆了RNA聚合酶的稳定期σs 因子编码基因rpoS ,推测其氨基酸序列与铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌的同源性分别为 99 1 %、87 35 %和87 8%。利用体外定点插入突变和同源重组技术 ,构建了M1 8的rpoS突变株M1 8R- 。对突变株M1 8R- 合成抗生素吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)的动力学分析结果表明 ,在KB或PPM培养基中 ,突变株合成PCA的能力比野生型分别提高了 2 5或 5 78倍 ,但Plt的积累量不受影响。与野生型相比 ,突变株对碳源饥饿的耐性下降。同时 ,在碳源饥饿条件下对过氧化氢、乙醇和和氯化钠等环境胁迫的交叉保护性减小 。

假单胞菌M18rsmA^-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌 (Pseudomonassp .)M18是促进植物生长的根际细菌 ,能产生吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种不同的抗生素抑制植物病原菌 ,保护植物免受病害。运用PCR方法 ,从M18基因组中 ,扩增出rsmA基因部分片段 ,并以该片段为探针 ,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆 ,切取带有rsmA基因及两侧序列的 1 5kb片段 ,中间插入编码Kmr 的DNA片段 ,获得rsmA- 体外突变体。运用同源重组剔除技术 ,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R- 。突变株M18R- 生物合成Plt的能力比野生型M18提高 4倍 ,但是 ,PCA产量仅为野生型的 2 0 %。研究结果表明 ,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。

绿针假单胞菌ARTP诱变及高产菌株的选育

生防菌绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)对多种植物的病原菌有较强的拮抗作用,经过3轮常温常压等离子体诱变处理后,筛选得到1株突变菌株的主要次级代谢产物吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)含量较出发菌株提高了79.5%。

假单胞菌M-18qscR突变株的构建及其对抗生素合成的调控

在革兰氏阴性菌中,全局性调控因子QscR参与菌群传感调节系统,调节多种毒素因子、次生代谢产物、稳定期基因以及参与生物膜形成的基因的表达,它通过与靶基因DNA启动子的调节元件结合,调节基因转录。假单胞菌株(Pseudomonas sp.)M-18是促进植物生长的根际细菌,能同时分泌藤黄绿菌素(pyoluterion,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid,PCA)。运用同源重组技术,构建了假单胞菌(Pseudomonas sp.)M-18株的qscR突变菌株M-18Q。比较野生株M-18和突变株M-18Q生物合成PCA和Plt的产量,在28℃恒温条件下,在PPM和KMB培养基中M-18Q菌株合成PCA的量分别约为野生型M-18菌株的4～6倍和3～5倍,分别达到480μg/mL和140μg/mL。在PPM培养基中,野生株M-18和突变株M-18Q几乎都没有Plt的合成,而在KMB培养基中,突变菌株和野生型M-18合成Plt的量基本一致。反式互补实验表明,在qscR突变株M-18Q中,PCA生物合成受到抑制而Plt的生物合成却不受影响。phzA基因是吩嗪合成基因簇中第一个基因,phzA‘-’lacZ翻译融合实验表明,qscR基因产物通过抑制PCA合成基因簇的表达,实施负调控作用。结果表明qscR基因是作为一个全局调控基因区别性地调控PCA和Plt的生物合成。

温度对假单胞菌rsmA突变株M-18R合成Plt和PCA的区别性影响

次生代谢物阻遏蛋白 (Repressorofsecondarymetabolite ,Rsm)A是一种全局性调控因子 ,与mRNA的RBS结合 ,转录后水平上抑制基因翻译。运用同源重组技术 ,构建了假单胞菌 (Pseudomonassp .)M_18的rsmA突变菌株M_18R。在 37℃、2 8℃恒温和短期升温 (37℃、4h培养 ,转 2 8℃继续培养 )条件下 ,比较野生株M_18和突变株M_18R生物合成藤黄绿菌素 (Plt)和吩嗪_1_羧酸 (PCA)的量。在 37℃条件下 ,M_18和M_18R合成这两种抗生物质的能力几乎受到完全抑制。在 2 8℃条件下 ,M_18R合成Plt的量约为野生型M_18的 10倍 ,达到 2 70 μg mL ,但是合成PCA的量仅为野生型的 5 0 %。经短期升温培养 ,M_18的Plt合成量明显下降 ,PCA产量降低不显著 ;相反 ,M_18R合成Plt的量达到 4 0 0 μg mL ,但PCA产量的变化仍不明显。推测 ,M_18菌株细胞内存在着某种与RsmA相关联的温度敏感因子 ,在RsmA缺失条件下 ,作为专一性激活剂促进Plt的生物合成 ,但是 ,并不参与对PCA合成的调控。

一株拮抗辣椒疫霉的假单胞菌的分离与鉴定

从甜椒根际土壤中分离到一株对辣椒疫霉(Phytophthora capsici)具有强拮抗作用的假单胞属(Pseudomonasspp.)菌株GP72,研究其拮抗性表明,对多种植物病原真菌均有很强的抑制作用。对该菌株进行形态特征、生理生化、Biolog GN、(G+C)mol%含量测定及16S rDNA序列分析,鉴定为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。特征为单细胞,极生单个鞭毛,不能利用聚β-羟基丁酸盐,能够较强地利用Biolog系统95种碳源中的45种作为底物生长,较弱利用其中的6种底物,与绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)的相似性达到98%,相似指数为0.72。用热解链方法测得基因组DNA的(G+C)mol%含量为65.1mol%。以16S rDNA序列为基础构建了包括13株邻近种属细菌在内的系统发育树,其中与模式致金色假单胞菌的同源性最近。

假单胞菌HT66的PhzI-PhzR调控系统的功能研究

绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66是一株分泌高水平吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,简称PCN)的植物根际促生细菌。通过全基因组测序与分析,发现phz基因簇上游存在着PhzI-PhzR双元调控系统。显色实验表明,野生株信号分子抽提物不能使指示菌紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)CV026显紫色,但能使指示菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)NTL4显蓝色。研究采用基因无痕敲除方法构建了突变株ΔphzⅠ、ΔphzR;与野生株相比,ΔphzⅠ突变株丧失了PCN合成能力,对终极腐霉的抑制作用明显下降;而且突变株ΔphzⅠ的信号分子抽提物也不能使指示菌NTL4菌显色。由此可见,菌株HT66以高丝氨酸内酯作为群体感应的信号分子,且吩嗪的生物合成受到了PhzI-PhzR的严格调控。进一步形态观察表明,突变株ΔphzⅠ的菌落颜色变为乳白色,鞭毛泳动性与野生株相比大大降低,但其群体从动性变化不显著。