有机溶剂/缓冲液两相体系中全细胞催化拆分环氧氯丙烷

研究了有机溶剂/缓冲液两相体系中重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)全细胞水解动力学拆分外消旋环氧氯丙烷制备(R)-环氧氯丙烷的过程.结果表明,最适反应条件为:最适有机溶剂异辛烷与缓冲液的体积比7:3,最适缓冲液pH8.0,底物浓度574mmol/L,全细胞加入量0.07g湿菌体/ml溶液,温度30oC.在此条件下于1L反应器中反应45min,(R)-环氧氯丙烷的摩尔产率、光学纯度和时空产率分别达到37.5%,99.3%ee和0.286mol/(L·h).与单一水相体系相比,异辛烷/缓冲液两相体系中底物浓度和(R)-环氧氯丙烷时空产率分别提高了55.2%和98.6%.

有机溶剂/缓冲液双相体系中绿豆环氧化物水解酶催化环氧苯乙烯不对称水解反应

研究了有机溶剂/缓冲液双相体系中绿豆环氧化物水解酶高立体选择性地催化外消旋环氧苯乙烯水解生成(R)-苯基乙二醇反应.结果表明,与单水相反应体系相比,有机溶剂/缓冲液双相反应体系不仅有效地抑制环氧苯乙烯的非酶水解反应,而且明显提高底物的浓度,产物的收率和ee值更高.在所考察的不同有机溶剂中,正己烷不仅能较好地溶解底物,而且对酶的毒性较小,从而导致反应的初速率较快,产物的收率和ee值较高,是最适宜有机相.在两相体积比(正己烷/缓冲液)为1:1,底物浓度为20mmol/L,缓冲液pH=6.5以及35oC的最适反应条件下,反应的初速率、产物的收率和ee值分别为5.42mmol/(L·h),49.2%和94.3%.

有机溶剂/缓冲液双相体系中固定化Acetobacter sp.CCTCC M209061细胞催化1-(4-甲氧基)-苯基乙醇不对称氧化反应

在有机溶剂/缓冲液双相体系中,利用固定化醋酸杆菌Acetobacter sp.CCTCC M209061细胞高对映体选择性地催化1-(4-甲氧基)-苯基乙醇(MOPE)的不对称氧化反应,成功地拆分外消旋MOPE得到对映体纯(S)-MOPE.与游离细胞相比,固定化细胞催化反应速度有所降低,但其稳定性(包括操作稳定性、热稳定性和储藏稳定性)明显提高.固定化细胞连续使用10批次(每批次12 h)后,仍能保留其初始催化活性的58%以上,而游离细胞仅保留约20%的相对活性.在所考察的不同有机溶剂中,正己烷不仅能较好地溶解底物,而且对细胞的生物相容性相对较好,因而提高了反应底物浓度、反应初速度、对映体回收率及残留底物e.e.值,是反应体系中最适宜的有机相.该反应的最适宜正己烷体积分数为60%,辅底物为50 mmol/L丙酮,底物浓度为40 mmol/L,缓冲液pH=6.5,反应温度为30℃;在此条件下,反应初速度为80.4μmol/min,反应12 h后,对映体回收率和残留底物e.e.值分别为51.0%和99.9%,明显好于水单相反应体系.

两相体系中全细胞转化法制备托莫西汀中间体

研究了磷酸盐缓冲液/有机溶剂两相体系中,热带假丝酵母Candida tropicalis CGMCC NO.15016不对称还原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的过程.利用二硝基水杨酸(DNS)法研究了有机溶剂对细胞的毒性,采用单因素法考察了相体积比、温度、磷酸盐缓冲液pH、底物浓度和菌体浓度等对不对称还原转化的影响,确定了V(磷酸盐缓冲液)∶V(邻苯二甲酸二丁酯两相体系)=1∶1为最佳反应体系,在最优转化条件下,转化率及对映体过剩值均可达到100%.

提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量

聚合酶链式反应(PCR)技术仅产生数年,却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域。它能快速、特异地扩增出任何所希望的目的基因或DNA片段,用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面。目前PCR扩增DNA片段长度可达到近50kb,这在生物学研究特别是在基因组图谱的绘制和测序中将起到革命性作用。扩增片段的能力达到近20～50kb,也将具有其它潜在的应用价值,如可以分离出完整的基因。

庆大霉素分泌过程的初步研究

应用恒温系统及缓冲液体系 ,考察了温度及 p H值对分泌过程的影响 ,然后在此基础上又讨论了添加葡萄糖、金属离子 Fe2 +、K+和 Mn2 +以及超声波和微波处理的效果。实验发现 ,p H=7.4,温度 34°C,以及添加 5 g/L KCl或 5 0 mg/L Mn SO4

重组人促红素的连续聚乙二醇化反应

为了达到提高重组人促红素(EPO)的聚乙二醇(PEG)化反应单取代率的目的,建立了一种EPO的连续PEG化反应方法。首先,对保存于4℃冰箱24个月的PEG-EPO反应液进行分析,结果表明其具有很好的长期稳定性。同时,圆二色谱(CD)测试结果显示,EPO在不同的缓冲液体系中,其蛋白质二级结构特征略有不同。接着,在不改变缓冲液体系的情况下,进行了EPO的直接二次PEG化反应;另外,采用双缓冲液体系,进行EPO的二次PEG化反应。结果表明,一次PEG化反应得到的PEG-EPO反应液体系具有很高的稳定性,不能直接进行二次PEG化反应;应用双缓冲液体系,则可实现EPO的连续PEG化反应,所得PEG-EPO反应液的单取代率高于54%。最后,采用双缓冲液体系,成功地进行了EPO的连续3次PEG化反应。对纯化得到的单取代产物(monoPEG-EPO),进行了高效液相色谱、荧光光谱、电泳、唾液酸含量、体内活性以及PEG化修饰位点等测试。测试结果表明,EPO在经过连续3次PEG化反应后,仍然可以很好地保留其生物活性和蛋白质结构,同时其PEG化修饰位点也没有发生显著改变。这些研究结果为开发一种新型的高单取代率的EPO的PEG化反应方法提供了基础,有望降低PEG-EPO长效药物的制备成本。

注射用替加环素无菌检查的研究及优化

目的:研究注射用替加环素质量标准中无菌检查项的现存问题并对检验方法进行优化。方法:分析7家企业质量标准中无菌检查项的内容,并对样品溶液pH范围、不同缓冲液对样品中微生物的影响、检查用样品溶液的稀释浓度、缓冲液中Mg^2+浓度对替加环素及杂质抑菌性的消除、冲洗液用量等问题展开试验。结果:不同配制方法所得注射用替加环素溶液pH范围在4.70~6.93,符合大多数微生物生长范围;不同缓冲液对注射用替加环素溶液的无菌检查无明显影响,考虑到pH 7.0氯化钠-蛋白胨溶液更适宜偏酸或偏碱的样品、0.9%氯化钠溶液会在后续试验中增加离子干扰,故0.1%蛋白胨水溶液为最适宜的基础性缓冲液;7家企业中仅有2家企业在无菌检查中使用Mg^2+作为中和剂,但所用Mg^2+浓度均不能最大限度地消除注射用替加环素的抑菌作用,经研究发现,0.10 mol·L^-1为缓冲液中最佳Mg^2+浓度,与替加环素和杂质(替加环素差向异构体、9-氨基米诺环素、9-硝基米诺环素)的金属络合反应可瞬间发生并完成,可消除部分抑菌性;1.25 mg·mL^-1注射用替加环素浓度为稀释数值的拐点,此浓度下污染微生物可在较低稀释级生长;300 mL的0.1%蛋白胨水溶液为适宜的冲洗液用量,此用量下所有人工污染的样品均可24 h检出阳性。结论:新缓冲液体系减少了缓冲液和冲洗液的整体用量,特别是冲洗液的用量,同时缓冲液中Mg^2+浓度适宜,适合本次国抽的注射用替加环素无菌检查,可为该品种质量标准中无菌检查项的修订和统一提供一定的参考。