糖皮质激素在受体介导下抑制胶原编码基因表达引发软骨成骨损伤机制

目的研究糖皮质激素诱导软骨损伤的内在机制。方法选用3种不同浓度的经典糖皮质激素泼尼松龙处理斑马鱼幼鱼,用同样量的二甲基亚砜(0.01%)处理同胞幼鱼作为对照组。在第4、5和6天采集处理后的样本进行软骨染色实验;采集6 d后的样本进行qRT-PCR分析;使用JASPAR在线软件预测和分析6个胶原编码基因的糖皮质激素反应元件,并构建由6个胶原编码基因组成的启动子驱动的荧光素酶报告载体,将其与糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)和/或糖皮质激素泼尼松(prednisone,PN)转染到细胞中,测量荧光素酶活性。结果PN 25μmol/L浓度对斑马鱼软骨造成明显损伤。随着PN处理浓度的增加,胶原蛋白编码基因相对mRNA水平显著降低。单次转染GR后,除col10a1a外,所有胶原编码基因的荧光素酶活性均降低;单次添加PN后,6个基因的荧光素酶活性均降低;当GR和PN同时添加时,荧光素酶活性显著降低。结论PN可引起明显的斑马鱼软骨发育损伤,胶原蛋白编码基因表达降低是PN引起斑马鱼软骨损伤的原因,而PN通过GR抑制胶原编码基因的表达。

成骨不全一家系1型胶原α1链基因新突变

目的检测一个非近亲婚配的成骨不全家系中5例患者的1型胶原α1链(COL1A1)基因突变位点。方法收集一个成骨不全家系的临床资料,每例患者采用双能X线吸收仪检测其L1～L4、股骨颈和全髋部位的骨密度(BMD),并采用聚合酶链反应及直接测序法对家系内成员及50名对照者进行COL1A1基因突变位点检测。结果根据临床表现和放射学资料,该家庭中5例患者被诊断为Ⅰ型成骨不全显性遗传。该家系中成骨不全患者均存在COL1A1基因的第28外显子的两个碱基(AG)缺失造成的突变(p.Gly632x),均为杂合突变,导致632Gly之后的氨基酸编码提前终止,而在家系内正常个体及其他正常对照者中均未发现该突变。除先证者姨妈和表哥的L1～L4BMD低于同龄正常人外,其他患者的BMD基本与同龄正常人相似。结论本研究首次发现了位于COL1A1基因第28外显子的新突变位点可导致Ⅰ型成骨不全,为进一步探讨COL1A1基因型和成骨不全表型的关系提供了依据。

表皮松解性角化过度鱼鳞病COL7A1基因突变研究

目的探讨一个表皮松解性角化过度鱼鳞病家系基因的突变。方法提取表皮松解性角化过度鱼鳞病患者及家族成员的基因组DNA,采用PCR扩增COL7A1基因所有的外显子及其邻近的剪切点并进行双向直接测序,用PCR检测突变位点从而进一步确定家系的致病原因。结果发现患者COL7A1基因的一条等位基因第2号外显子上存在S48P的错义突变,而另一条等位基因第27号外显子上存在3625del11缺失突变,造成编码区阅读框架的移位,最终导致蛋白终止密码(PTC)的生产。结论COL7A1基因的缺失突变和错义突变引起该患者临床症状的特异突变。

成骨不全一家系的COL1A1基因突变分析

目的探讨一个成骨不全家系的COL1A1基因的突变位点及其与临床特征的关系。方法收集一个成骨不全家系的临床资料,采用聚合酶链反应以及直接测序法对家系内成员进行COL1A1基因突变位点检测,同时对50名无血缘关系健康对照者的该位点进行限制性内切酶分析。结果该家系中成骨不全患者均存在COL1A1基因的第2461位点G→A突变(G821S),但其临床特征不一致。而在家系内非患者及正常对照者中均未发现该突变。结论COL1A1基因突变是中国人群中成骨不全致病原因之一。成骨不全的表型不仅与基因型有关,还与遗传背景有关。

间充质干细胞细胞外基质改变脂肪来源干细胞微环境影响其生物学行为的机制分析

目的探究通过加入间充质干细胞产生的细胞外基质,从而改变肪来源干细胞的微环境后,使得脂肪来源干细胞增殖转化功能改善的核心分子和作用机制。方法采用生物信息学方法,从基因表达谱芯片数据库中获取12组供体的转录组信息,并分为4组:Ad on NHDF组,记录在聚苯乙烯培养基中加入人新生儿真皮成纤维细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on Bm组,记录在聚苯乙烯培养基加入骨髓来源间充质干细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on Ad组,记录在聚苯乙烯培养基加入脂肪来源干细胞的细胞外基质后,脂肪来源干细胞的转录组表达情况;Ad on TCPS组,记录脂肪来源干细胞在单纯的聚苯乙烯培养基的转录组表达情况。采用京都基因与基因组百科全书、基因本体、基因集合富集分析等富集分析手段,并利用软件R、Perl、Cytoscape进行差异分析和数据可视化。结果每种间充质干细胞产生其特定的细胞外基质,但在加入不同的细胞外基质培养基培养后的脂肪来源干细胞,都共享部分差异表达的基因和蛋白,如编码胶原家族基因。通过进一步将共享差异基因和功能集团构建蛋白互作关系,最终确定出改变微环境后影响脂肪来源干细胞增殖分化的3个重要分子COL4A1、COL11A1、COL15A1,分子的低表达可能与细胞修复、核苷酸代谢、DNA复制和细胞周期等多种生物学反应和信号通路相关。结论加入间充质干细胞产生的细胞外基质培养基培养的脂肪来源干细胞,编码胶原的基因表达量显著下调,并通过多种途径参与脂肪来源干细胞的增殖分化。