慢性神经痛大鼠脊髓缝隙连接蛋白43基因表达变化的实验研究

目的:研究慢性神经痛大鼠脊髓缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)基因表达的变化.方法:18只成年SD大鼠随机分为两组(n=9),分别接受右侧坐骨神经结扎手术(CCI组)和假手术(Sham组).手术前、后观察大鼠疼痛行为学并测定右后肢热刺激抬脚潜伏期(PWTL)、电刺激抬脚阈值(PWET)的变化,于术后14天取大鼠L4/5右侧脊髓,以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照基因,采用RT-PCR半定量分析CCI组和Sham组Cx43表达的差异.结果:CCI组大鼠表现为行走步态异常,与Sham组相比CCI组术后5～14天疼痛阈值明显降低(P＜0.01).Sham组Cx43扩增产物量极少,而CCI组L4/5 Cx43扩增产物量约为Sham组的3倍.结论:慢性神经痛大鼠脊髓Cx43基因表达显著增加,提示脊髓缝隙连接可能在慢性病理性痛过程中发挥重要的作用.

兔窦房结组织急性损伤后缝隙连接蛋白CX45 CX43表达的研究

目的 :研究兔窦房结组织急性损伤后缝隙连接蛋白CX4 5、CX4 3表达的动态变化规律。方法 :用 2 0 %甲醛湿敷兔窦房结区 ,建立窦房结组织急性损伤模型。分别于模型建立后 2h ,1周 ,2周 ,3周和 4周取窦房结组织 ,用免疫组织化学SP法检测CX4 5和CX4 3的表达。结果 :CX4 5主要在窦房结中心区表达 ,表达的CX4 5呈点状、短线状 ,形状不规则 ,分布稀疏 ;CX4 3在窦房结中心无表达 ,而表达于窦房结周边区心房肌细胞 ,呈条状、链状 ,分布于心房肌闰盘处。各实验组窦房结细胞CX4 5表达量均较对照组明显减少 (P <0. 0 5 ) ,且随观察时间的延长CX4 5表达量逐渐减少。结论 :兔窦房结细胞表达CX4 5 ,而无CX4 3的表达。窦房结组织急性损伤后CX4 5的表达量明显减少。

缝隙连接蛋白40基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系

目的探讨缝隙连接蛋白40(Cx40)基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死(ACI)易感性的相关性。方法采用SNa Pshot技术对342例ACI患者(病例组)和296例健康者(对照组)的Cx40基因启动子区多态性位点rs35594137进行基因型检测,采用荧光定量PCR方法检测外周血单个核细胞Cx40 mRNA相对表达水平,并分析其与rs35594137位点多态性的相关性。结果病例组rs35594137位点的基因型和等位基因频率分布与对照组比较,差异均有统计学意义(基因型:P=0.003;等位基因A vs G:P=0.001,OR=1.479);病例组Cx40 mRNA相对表达水平低于对照组(P<0.05);对照组AG+AA基因型(A等位基因携带者)的Cx40 mRNA相对表达水平低于GG基因型(P<0.05)。结论 Cx40基因启动子区多态性位点rs35594137与ACI易感性相关,A等位基因是ACI发病的危险因素。

缝隙连接蛋白43基因多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性研究

目的分析缝隙连接蛋白43(Cx43)基因多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死(ACI)的关系。方法采用SNaPshot技术对300例ACI患者(病例组)和300例健康体检者(对照组)的Cx43基因启动子区rs2071166多态性位点进行基因型检测,采用荧光定量PCR检测外周血单个核细胞Cx43 mRNA相对表达量,并分析其与rs2071166位点基因型的关系。结果病例组rs2071166位点的等位基因和基因型频率分布与对照组相比差异均有统计学意义(等位基因C vs.A:OR=1.569,P=0.001;基因型AA vs.AC vs.CC:P=0.008);病例组Cx43 mRNA相对表达量明显低于对照组(P<0.05);对照组CC+AC基因型(C等位基因携带者)的Cx43 mRNA相对表达量明显低于AA基因型(P<0.05)。结论Cx43基因启动子区rs2071166位点与ACI易感性相关,C等位基因可能是ACI发病的危险因素。

经尿道灌注SCL和GJA1基因慢病毒对糖尿病膀胱病变中CD117和Cx43蛋白及其mRNA表达的影响

目的:探索灌注干细胞白血病SCL和GJA1基因慢病毒对糖尿病膀胱病变中CD117(c-kit)和Cx43蛋白及其mRNA表达的影响。方法:选取70只健康成年雄性豚鼠,称量体重在300~400 g之间,一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)200 mg/kg,浓度1%,构建豚鼠糖尿病膀胱模型,经尿流动力学筛选出26只成模型豚鼠。随机将24只糖尿病膀胱模型豚鼠分为4组,每组6只:阴性对照组(n=6)、Cx43组(n=6)、CD117组(n=6)、CD117+Cx43组(n=6)。阴性对照组将未携带基因的慢病毒+PBS液0.2 ml单次经尿道灌注,CD117组单次经尿道灌注SCL基因重组慢病毒药物(滴度2×10^(7)U)0.2 ml,Cx43组单次经尿道灌注GJA1基因重组慢病毒药物(滴度2×10^(7)U)0.2 ml,CD117+Cx43组单次经尿道灌注SCL+GJA1基因重组慢病毒药物(滴度2×10^(7)U)0.2 ml。灌注结束后迅速结扎尿管至2 h后解除尿管。各组的糖尿病豚鼠膀胱在结束灌注后第14天时于无菌操作和全身麻醉下取出,将组织迅速冻存于-80℃冰箱,ICC表面CD117蛋白和缝隙连接蛋白Cx43的表达通过Western印迹检测,CD117和Cx43mRNA表达情况通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测,采用免疫组织化学染色(1HC)法观察Cx43蛋白和ICC表面CD117蛋白在豚鼠膀胱中的分布和染色强度。结果:Western印迹显示CD117+Cx43组、Cx43组和CD117组的CD117蛋白及Cx43蛋白表达均高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CD117+Cx43组的CD117蛋白和Cx43蛋白表达均高于Cx43组和CD117组,差异有统计学意义(P<0.05);qRT-PCR检测发现CD117+Cx43组、Cx43组和CD117组的CD117和Cx43mRNA表达均高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CD117+Cx43组的CD117和Cx43mRNA表达均高于CD117组和Cx43组,差异有统计学意义;1HC结果显示CD117+Cx43组的CD117蛋白和Cx43蛋白的免疫染色强度均高于CD117组、Cx43组和阴性对照组。结论:SCL和GJA1基因重组慢病毒均能在糖尿病豚鼠膀胱中成功转染,两种慢病毒联合灌注较单一的慢病毒灌注表达的CD117和Cx43蛋白及其mRNA更高。

Cx43基因在人类及小鼠胎心发育中的时空表达规律

目的 检测Cx4 3在人类和小鼠的胚胎心脏的表达 ,了解该基因在心脏发育过程中的表达规律。方法 选取人类 6～ 18孕周正常胚胎或胎儿心脏 6 3例 ,小鼠孕龄 9 5～ 16 5d胚胎心脏 6 4例 ,采用免疫组化法显示Cx4 3基因在心脏的表达。结果 早期人类胚胎心脏中 ,Cx4 3在心室肌中没有表达 ,心房肌表达微弱 ,原始小梁网中表达很高 ,随着胚胎发育 ,在心房和心室的表达逐渐增强 ,小梁网的表达在胚胎 13～ 14周达到高峰。室间隔的肌部表达量较弱 ,膜部室间隔不表达。房室瓣和大动脉根部管壁Cx4 3没有明显表达。除了在大动脉管壁表达不同 ,小鼠胚胎心脏表达规律与人类基本相同。结论 Cx4 3对于胚胎心脏的发育至关重要。

VSMC-Cx43^(-/-)条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43^(-/-))模型。方法采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰。通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体,该载体包含3.0 kb 5’同源臂、1.9 kb的flox区域和3.0 kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得3只阳性F1代小鼠(Cx43^(flox/+))。将获得的flox杂合子Cx43^(flox/+)小鼠自交,获得flox纯合子Cx43^(flox/flox)小鼠。然后用Cx43^(flox/flox)小鼠和Myh11-CreERT2小鼠交配,最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠(该小鼠简写为:VSMC-Cx43^(-/-))和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠(Cx43^(flox/flox))。用PCR进行基因型鉴定,用Western blot技术检测Cx43在大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。结果基因型鉴定、免疫荧光和Western blot检测结果表明VSMC-Cx43^(-/-)基因敲除小鼠模型构建成功,小鼠一般性状无改变,小鼠大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中Cx43蛋白表达均下降。因此,可作为长期稳定模型研究血管平滑肌Cx43的功能。结论应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统成功构建了VSMC-Cx43^(-/-)基因敲除小鼠模型,为深入研究Cx43在血管疾病中的作用提供工具。

GJB2基因突变引起耳蜗功能改变的机制

GJB2基因是最常见耳聋基因,主要编码的缝隙连接蛋白26(connexin26,Cx26)是耳蜗中最重要的一种缝隙连接蛋白;缝隙连接系统在维持耳蜗内的正常钾循环及微环境中起重要作用。GJB2基因是耳蜗中表达最强的一种连接蛋白,参与构成耳蜗中的缝隙连接(gap junction,GJ)系统,对于维持内耳微环境及细胞间的协调稳定具有重要作用。

一个新的GJA8突变导致一家系遗传性白内障

目的鉴定一个新的常染色体显性遗传性白内障家系的致病性基因突变。方法在前期对本家系基因定位研究的基础上,通过对GJA8基因测序鉴定致病基因及酶切电泳验证突变。结果对缝隙连接蛋白50(connexin50,CX50;编码为GJA8)基因DNA序列分析鉴定显示其第2个外显子的773位核苷酸上C到T的杂和错义突变,引起其蛋白产物258位丝氨酸被苯丙氨酸替代。结论本研究在一遗传性白内障家系发现并鉴定了一个新的GJA8错义突变(S258F),并认为其与导致该家系常染色体显性遗传性白内障发病有关。

有汗性外胚叶发育不良基因突变检测分析

目的对1例散发型有汗性外胚叶发育不良(Hidrotic ectodermal dysplasia,HED)患者进行基因突变检测,为产前诊断和遗传咨询提供依据。方法采用PCR扩增缝隙连接蛋白beta-6基因(gap junction protein beta 6 gene,GJB6)基因外显子区,通过DNA直接测序的方法,对患者、患者家庭中正常人和100例健康对照进行GJB6基因突变检测。结果患者在GJB6基因上第31位发现一错义突变,鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)转换,由此,第11位氨基酸密码子由GGG突变成AGG,导致甘氨酸(G)被精氨酸(R)替代,即G11R;而患者家庭中的正常人和100例健康对照均没有发现同样的碱基改变。结论患者GJB6基因存在错义突变(31G>A)是导致HED的主要原因。

家族性常染色体遗传性白内障家系的连锁分析

目的:针对缝隙连接蛋白50基因的突变筛查结果验证该基因是否为这一家族性常染色体遗传性白内障家系遗传性白内障的致病基因。方法:选取缝隙连接蛋白50基因所在1号染色体附近的微卫星位点和缝隙连接蛋白50基因序列上的单核苷酸多态性位点进行连锁分析。结果:该家系遗传性白内障疾病候选基因与微卫星位点D1S498和缝隙连接蛋白50基因单核苷酸多态性位点Rs1495960和Rs9437983有连锁趋势。当θ=0时,在缝隙连接蛋白50基因的单核苷酸位点上,LOD值最大,为0.3。结论:验证了该家系遗传性白内障的致病基因为突变的缝隙连接蛋白50基因。