转化生长因子-β_1对大鼠心房纤维化和缝隙连接蛋白40重构的影响

目的:采用大鼠心房纤维化的模型,探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对大鼠心房纤维化和缝隙连接蛋白(Cx)40重构的影响及阿托伐他汀的防治作用。方法:将30只雄性Wistar大鼠随机等分为对照组(A)、盐酸异丙肾上腺素组(B)、盐酸异丙肾上腺素+阿托伐他汀组(C)。8周后处死,Masson染色法测大鼠心房纤维化程度,免疫组化法显示大鼠心肌组织TGF-β1和Cx40分布特征,并半定量统计分析。rt-PCR测大鼠心肌组织中Cx40mRNA表达情况。结果:与A组相比,B组大鼠心肌组织TGF-β1含量显著升高(P<0.01),心房纤维化程度增加,Cx40含量显著减少(P<0.01),且分布紊乱;与B组相比,C组大鼠心肌组织中TGF-1β含量减少(P<0.05),心房纤维化程度明显减轻,Cx40含量升高(P<0.05),分布基本恢复正常;与A组相比,C组大鼠各指标均无明显变化(P>0.05)。结论:心肌组织中TGF-β1含量增加可能是心房纤维化和Cx40重构的机制之一;阿托伐他汀可通过降低心肌组织中TGF-β1含量显著改善心房纤维化程度和Cx40重构。

缝隙连接蛋白40与心房颤动的关系

缝隙连接通道大量分布于心脏组织,介导心肌细胞之间直接通讯,在维持心肌电活动的同步性及冲动在心肌快速传导方面发挥着重要的生理功能。缝隙连接蛋白(connexin,Cx)40的表达量、分布及分子结构变化均与心房颤动有关。该文介绍Cx40的表达、分子变异与心房颤动的关系以及基于Cx40靶标的抗心律失常治疗进展。

过表达连接子蛋白40(Cx40)通过引起细胞周期阻滞抑制H9c2大鼠心肌细胞增殖

目的 建立过表达连接子蛋白40(Cx40)的H9c2心肌细胞稳定株,初步探讨慢病毒载体介导的Cx40蛋白过表达对H9c2细胞增殖的影响及其相关机制。方法 采用实时定量PCR从H9c2细胞株扩增Cx40基因片段,与慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro连接,获得重组pLVX-Flag-Cx40表达载体。通过与包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,获得携带Flag-Cx40的重组慢病毒颗粒。感染的H9c2细胞经嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定表达株(H9c2-Flag-Cx40细胞)。采用Western blot法检测Cx40蛋白表达情况;通过CCK-8法检测Cx40对H9c2细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期的变化;实时定量PCR检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的mRNA表达;Western blot法检测cyclin D1蛋白表达;免疫共沉淀(Co-IP)实验检测H9c2细胞Cx40和Yes相关蛋白(YAP)的相互结合情况;分离胞质、胞核蛋白,利用Western blot法检测Cx40对YAP细胞定位的影响。结果 测序结果显示成功构建重组pLVX-Flag-Cx40表达载体,Flag-Cx40重组慢病毒可在H9c2细胞过表达,H9c2-Flag-Cx40稳定细胞株构建成功。与对照组相比,过表达Cx40明显降低H9c2细胞的增殖速率,细胞周期阻滞在G0/G1期,cyclin D1表达量降低。H9c2-Flag-Cx40稳定转染细胞的胞质中YAP表达量明显增多,而在胞核中的表达量明显减低,Cx40通过在胞质中与YAP结合,阻止其进入细胞核发挥转录共激活作用。结论 慢病毒介导Cx40基因过表达使H9c2细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期,并抑制其增殖。

电除颤术后窦房结缝隙连接蛋白40的表达

目的：探讨人工心肺复苏电除颤术后缝隙连接蛋白40（Connexin40，Cx40）在窦房结（SAN）中的表达。方法：从2008年至2010年成人尸体解剖案例中，筛选出20例，将其中心肺复苏过程中接受过电除颤者设为A组（n=7）；仅施行标准人工心肺复苏术而未接受电除颤者设为B组（n：8）；另选取5例正常窦房结组织设为对照组（C组，n=5）。窦房结取材，常规制片，分别行MASSON染色及免疫组化Cx40染色，用图像分析系统分析每高倍视野窦房结间质比例及窦房结中Cx40表达的IOD值，统计软件对所得数据进行分析。结果：A组窦房结间质比例与B组比较、A组与C组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；B组与C组比较，差异无统计学意义（P〉O．05）；A组SAN中Cx40表达10D值与B组比较、A组与C组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；B组与C组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：电除颤术后SAN间质胶原纤维和弹力纤维网状结构松散，部分断裂，水肿，SAN的自我保护功能部分受损；SAN中Cx40表达降低，GJ通道功能受损。

阿托伐他汀抑制血管紧张素Ⅱ诱导心房肌细胞肥大及对缝隙连接蛋白40的影响

目的观察阿托伐他汀对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心房肌细胞肥大及缝隙连接蛋白40(Cx40)表达的影响。方法20只1周龄左右Wistar大鼠,用于体外心房肌细胞的分离培养与鉴定。设置正常对照组、AngⅡ(1μmol/L)组、AngⅡ+二甲亚砜组和AngⅡ+阿托伐他汀0.1、1.0、10μmol/L共6组。72h后利用氚标亮氨酸掺入法检测心房肌细胞蛋白合成速率,逆转录聚合酶链反应分别检测脑钠肽的前体(Nppb)、转化生长因子(TGF)-β_1及Cx40 mRNA的表达。结果与正常对照组相比,AngⅡ组氚标亮氨酸掺入量和Nppb mRNA表达呈显著性增加(P<0.05),同时TGF-β_1 mRNA高表达而Cx40mRNA低表达,阿托伐他汀逆转上述变化,10μmol/L组作用最强(P<0.05),而作为溶剂的二甲亚砜无明显作用。结论阿托伐他汀可能通过抑制Nppb mRNA的高表达来逆转AngⅡ诱导的心房肌细胞肥大,抑制TGF-β_1mRNA的高表达减轻心房纤维化,同时可能通过增强Cx40 mRNA的表达来逆转缝隙连接蛋白的重构,最终减低房颤发生率。

不同类型心房颤动患者右心房肌缝隙连接蛋白40的分布及表达变化

目的观察非心房颤动者和不同类型心房颤动(房颤)患者右心房肌缝隙连接蛋白40的分布及表达变化,探讨其与右心房大小及房颤发生发展之间的关系。方法共收集23个右心耳心肌标本,非房颤组5个,阵发性房颤6个,持续性房颤5个及永久性房颤7个。采用彩超体表面积标准化法,比较右心房内径大小;免疫荧光共聚焦显微镜观察缝隙连接蛋白40定位分布情况;实时定量聚合酶链反应相对定量检测mRNA表达水平;Westernblot检测蛋白表达水平。结果房颤各组心房内径比非房颤组增大(P<0.05或P<0.01);非房颤组缝隙连接蛋白40主要表达于心肌细胞闰盘位置,而房颤组表达分布紊乱;在mRNA及蛋白表达水平上,阵发性房颤组缝隙连接蛋白40比正常组表达增高;持续性房颤组缝隙连接蛋白40比正常组表达降低;永久性房颤组缝隙连接蛋白40表达进一步降低(P<0.05或P<0.01),缝隙连接蛋白40表达与右心房大小呈明显负相关(R2=0.1938,P<0.05)。结论缝隙连接蛋白40分布紊乱及表达的变化与心房重构密切相关,可能是不同类型房颤发生发展的机制之一。

缺氧对膀胱平滑肌细胞缝隙连接蛋白40和缝隙连接蛋白43的影响

目的:探讨缺氧环境下缝隙连接蛋白(Cx40、Cx43)在mRNA水平上的变化,研究细胞缺氧和Cx40、Cx43表达变化在不稳定膀胱发病机理上的相关关系。方法:体外培养大鼠膀胱平滑肌细胞,建立细胞缺氧模型;在细胞缺氧1 h后收集细胞,运用逆转录-聚合酶链反应技术分析Cx40、Cx43。结果:缺氧1 h,Cx40、Cx43在mRNA水平上表达较正常氧对照组有明显升高(P<0.01)。结论:细胞缺氧会引起Cx40、Cx43在mRNA水平上表达的变化,这可能与不稳定膀胱的发生有密切联系。

缝隙连接蛋白40基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系

目的探讨缝隙连接蛋白40(Cx40)基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死(ACI)易感性的相关性。方法采用SNa Pshot技术对342例ACI患者(病例组)和296例健康者(对照组)的Cx40基因启动子区多态性位点rs35594137进行基因型检测,采用荧光定量PCR方法检测外周血单个核细胞Cx40 mRNA相对表达水平,并分析其与rs35594137位点多态性的相关性。结果病例组rs35594137位点的基因型和等位基因频率分布与对照组比较,差异均有统计学意义(基因型:P=0.003;等位基因A vs G:P=0.001,OR=1.479);病例组Cx40 mRNA相对表达水平低于对照组(P<0.05);对照组AG+AA基因型(A等位基因携带者)的Cx40 mRNA相对表达水平低于GG基因型(P<0.05)。结论 Cx40基因启动子区多态性位点rs35594137与ACI易感性相关,A等位基因是ACI发病的危险因素。

缝隙连接蛋白40增加急性肺损伤小鼠肺血管通透性

目的:探究缝隙连接蛋白40(connexin40,CX40)在小鼠急性肺损伤模型中与肺血管通透性的相关性。方法:将C57BL/6小鼠分为两组。对照组腹腔注射生理盐水,脂多糖组腹腔注射脂多糖建立肺水肿模型,两组小鼠注射后均饲养24 h,断颈处死取肺组织,分别采用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法以及免疫荧光法检测肺组织中CX40基因和蛋白的表达(以上每种检测方法每组各3只小鼠)。另将15只小鼠均分为3组,采用离体肺灌注系统,对照组在心肺离体后只给予普通灌流液灌注,血小板激活因子(platelet-activating factor,PAF)组在灌流液中加入PAF建立急性肺水肿模型,CX40抑制组则先在灌流液中加入CX40特异抑制性模拟肽gap2740进行灌注,15 min后再加入PAF继续灌注。通过离体肺灌注系统检测各组肺重量。结果:脂多糖组CX40的mRNA表达和蛋白表达均明显低于对照组(P<0.05),免疫荧光染色亦显示脂多糖组CX40的表达明显低于对照组。离体肺灌注实验中,使用PAF后小鼠肺重量急剧上升,出现剧烈肺水肿,但运用gap2740后,肺重量上升趋势明显缓解。结论:急性肺损伤时,虽然CX40表达降低,但其在功能上促进肺血管通透性的增高。

缝隙连接蛋白40与心房颤动发生及治疗关系的研究进展

心房颤动(简称房颤)是临床上最为常见的持续性心律失常。缝隙连接是将相邻细胞的细胞质进行连接的细胞内通道,对相邻细胞间的电传导至关重要,其结构和功能改变在房颤的发生和维持过程中发挥重要作用。缝隙连接蛋白40(Cx40)主要存在于心肌细胞间的闰盘处,是组成心房及其传导系统缝隙连接的主要成分。Cx40基因突变、分布和量的改变、磷酸化均与房颤的发生和维持相关。因此未来以Cx40为靶点的药物以及Cx40转基因治疗将会为房颤的治疗带来新的曙光。

自发性高血压大鼠外周血CD4^+/CD8^+T淋巴细胞比率增加且连接子蛋白40(Cx40)和炎症因子水平升高

目的探讨连接子蛋白40(Cx40)与自发性高血压大鼠(SHR)外周血CD4^+T细胞和CD8^+T淋巴细胞亚群及炎症因子之间的关系。方法采用流式细胞术检测Wistar京都(WKy)大鼠和SHR外周血CD4^+T细胞和CD8^+T细胞及其表面Cx40的表达;采用ELISA检测炎症因子白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-4、IL-6表达。结果 SHR收缩压显著高于WKy大鼠,SHR外周血CD4^+T细胞百分率、CD4^+/CD8^+T细胞比率显著高于WKy大鼠,而CD8^+T细胞百分率显著低于WKy大鼠;SHR血清IL-2、IL-4、IL-6水平均显著高于WKy大鼠,IFN-γ无明显差异;SHR外周血CD4^+T细胞和CD8^+T细胞中Cx40表达均显著高于WKy大鼠。结论 SHR外周血CD4^+/CD8^+T淋巴细胞比率增加,且Cx40和IL-2、IL-4、IL-6水平明显升高。

一氧化氮抑制大鼠T淋巴细胞TNF-α和IL-6的释放并下调连接子蛋白40(Cx40)水平

目的探讨一氧化氮(NO)对淋巴细胞上连接蛋白40(Cx40)表达及肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)释放的影响。方法取WKY大鼠腹主动脉外周血,收集淋巴细胞进行体外培养,分为对照组、伴刀豆球蛋白A(Con A)处理组、Con A联合NO处理组。ELISA检测培养基上清中TNF-α和IL-6水平,免疫荧光技术检测淋巴细胞Cx40的表达和分布,流式细胞术检测淋巴细胞Cx40表达频率的变化,Western blot法检测淋巴细胞Cx40的蛋白水平。结果与对照组相比,Con A处理组TNF-α和IL-6水平升高,Con A联合NO处理组较Con A处理组降低;Cx40表达在淋巴细胞的细胞质和细胞核,与对照组相比,Cx40蛋白表达水平和表达频数均增加,与Con A处理组淋巴细胞相比,Con A联合NO处理组Cx40蛋白表达水平和表达频数均明显降低。结论 NO抑制促炎因子TNF-α和IL-6释放,同时伴随下调淋巴细胞上Cx40的表达,提示Cx40可能参与NO的抑炎作用。

硫氢化钠抑制大鼠外周血淋巴细胞TNF-α和IL-6的释放并下调连接子蛋白40(Cx40)和Cx43水平

目的探讨硫氢化钠(NaHS)对淋巴细胞连接子蛋白40(Cx40)和Cx43表达及肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)释放的影响。方法选取清洁级Wistar京都(WKY)大鼠6只,采集腹主动脉外周血;密度梯度法分离淋巴细胞,分为对照组、伴刀豆球蛋白A (ConA)组、ConA联合NaHS组。ELISA检测培养细胞上清中IL-6和TNF-α的水平,免疫荧光染色技术检测淋巴细胞Cx40、Cx43表达和定位,流式细胞术检测淋巴细胞Cx40、Cx43表达频数,Western blot法检测淋巴细胞Cx40、Cx43的蛋白水平。结果与对照组相比,ConA组IL-6和TNF-α水平升高,ConA联合NaHS组较ConA组降低; Cx40主要表达在细胞质和细胞核,而Cx43主要表达在细胞膜上;与对照组相比,ConA组淋巴细胞Cx40和Cx43表达均明显增强、Cx40和Cx43表达频数及蛋白水平均升高;与ConA组相比,ConA联合NaHS组淋巴细胞Cx40和Cx43表达均降低、Cx40和Cx43表达频数及蛋白水平均降低。结论 NaHS处理抑制ConA处理引起的TNF-α和IL-6释放,下调淋巴细胞上Cx40和Cx43的表达。

针刺预处理“极泉”与“内关”穴对房颤大鼠房颤持续时间和Cx40蛋白及mRNA表达的影响

目的:探索针刺预处理“内关”穴和“极泉”穴对阵发性房颤大鼠的房颤持续时间、Cx40蛋白及mRNA表达的影响。方法:选取健康雄性wistar大鼠40只,随机分为正常组、模型组、内关组和极泉组,共4组。以Ach66μg/mL+CaCl210mg/mL混合液,连续7天经阴茎静脉注射诱发阵发性房颤大鼠模型。从造模第1天起对两针刺组分别针刺双侧穴位各20min后注射造模药物,正常组注射生理盐水,以心电图检测各组大鼠房颤持续时间。7天治疗结束后,用Western-blot法测定Cx40蛋白的表达,用Real-TimePCR法测定Cx40mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠房颤持续时间显著延长(P<0.01);与模型组比较,内关组、极泉组的房颤持续时间缩短(P<0.01)。Cx40蛋白在模型组表达最高(P<0.01),在正常组表达最低,经1周治疗后内关组、极泉组的Cx40蛋白表达水平均明显下调(P<0.01)。各组大鼠的Cx40mRNA表达水平无显著差异。结论:针刺预处理“极泉”穴与“内关”穴缩短房颤持续时间的效果相当,其机制可能与下调房颤大鼠心房肌心房缝隙连接蛋白Cx40的表达有关。

电刺激硬脑膜对三叉神经节连接蛋白40表达和痛阈的影响

目的:探讨三叉神经节中连接蛋白40在偏头痛发作中的临床意义。方法:将健康成年SD大鼠随机分为假手术组、对照组、实验0h组、实验12h组、实验24h组、实验48h组,采用电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜模型。应用免疫荧光和Westem blot技术观察各组三叉神经节连接蛋白40表达,应用von frey纤维丝测定大鼠眼周皮肤的痛觉阈值。结果:免疫荧光显示实验0h组、实验12h组、实验24h组连接蛋白40的表达均高于假手术组、对照组和实验48h组,于1 2h达表达高峰(P<0.05)。各组左右侧无统计学差异(P>0.05)。Western blot显示实验0h组、实验12h组、实验24h组连接蛋白40的表达均高于假手术组、对照组及实验48h组(P<0.05)。各组左右侧无统计学差异(P>0.05),于12h达表达高峰。Von Frey纤维丝测定显示实验组大鼠实验前1h、实验刺激后2h、12h、24h、48h左、右眼周皮肤的痛觉阈值呈先下降后上升的趋势,于12h达低点,48h基本恢复正常。结论:电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜可上调三叉神经节连接蛋白40的表达,降低大鼠面部的痛觉阈值,增强面部的痛觉敏化,表明连接蛋白40在偏头痛的发生及发展中可能起到一定作用。

心脏缝隙连接蛋白的研究进展

心肌细胞间的缝隙连接蛋白(Gap junction,GP)通道是其细胞间的一种特殊的蛋白连接通道,其功能主要是在细胞间起代谢偶联和电偶联作用,是心肌细胞维持电生理搏动的结构基础。近来的研究显示,心肌缝隙连接蛋白结构、功能的改变将导致心脏功能的改变,与心脏疾病的发生有密切的关系。

间隙连接蛋白40基因多态性与原发性高血压病的相关性研究

目的探讨间隙连接蛋白40基因(-44和+71位点)多态性与原发性高血压(EH)的相关性。方法运用聚合酶链反应PCR技术对210例原发性高血压病住院患者,对照组158例体检正常人的Cx40基因的-44和+71位点基因多态性、基因型、等位基因分布频率等进行统计学分析。结果病例组三酰甘油、钙、高密度脂蛋白(HDL)与对照组有统计学意义(P<0.05),CX40基因-44位点基因型病例组和对照组构成比总体及男性均存在统计学意义(P<0.05),+71位点无统计学意义(P>0.05)。Logistic回归提示-44位点AA基因型、三酰甘油、钙的OR值分别是4.458、4.1330、0.195,P分别是0.039、0.001、0.014。结论 Cx40基因启动子区域-44位点AA基因型可能是男性高血压人群的危险因素,高三酰甘油为危险因素,高钙为保护因素。

血管紧张素Ⅱ对大鼠心房纤维化及Cx40重构的影响

目的采用大鼠肾上腹主动脉部分结扎的模型,探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对心房纤维化和缝隙连接蛋白(Connexin,Cx)40重构的影响。方法将40只雄性Wistar大鼠随机等分为对照组(C组)、腹主动脉结扎组(AB组)、结扎+贝那普利组(B组)、结扎+缬沙坦组(V组)。B组给予贝那普利20mg/kg治疗,V组给予缬沙坦40mg/kg治疗。喂养8周后处死,用放射免疫法测血浆及心肌组织AngⅡ含量,用Masson染色法和免疫组化方法检测大鼠心房纤维化程度及Cx40的分布特征,半定量分析心房纤维组织含量和Cx40的分布密度。结果与C组相比,AB组和V组血浆、心肌AngⅡ含量均明显升高(P均<0.01),而B组则无明显变化(P>0.05)。AB组心房纤维组织含量较C组明显升高(P<0.01),而Cx40分布密度减低(P<0.01),且向侧边分布增加;B组和V组纤维组织含量较AB组显著降低(P均<0.01),而两组Cx40含量较AB组增加(P均<0.01),且分布不均一程度减轻。结论AngⅡ长期升高可能是导致心房纤维化和Cx40重构的重要机制之一;贝那普利及缬沙坦可有效减轻心房纤维化和Cx40的重构。

定心胶囊对房颤大鼠心房肌组织Ca^(2+)-ATP酶及Cx40基因表达影响的试验研究

目的:通过动物试验观测中药制剂定心胶囊对房颤大鼠心房肌组织Ca^(2+)-ATP酶及缝隙连接蛋白40 (Connexon 40,Cx40)基因表达的影响,揭示定心胶囊防治房颤的作用机理。方法:选用体重在200～250g的健康雄性Wistar大鼠,采用乙酰胆碱-氯化钙(Ach-CaCl_2)混合液以鼠尾静脉给药的方式建立房颤的动物模型。用药4周后,观察指标变化。结果:定心胶囊治疗组和维拉帕米对照组与模型组比较,能明显升高心房肌组织Ca^(2+)-ATP酶基因表达及降低Cx40基因表达(P<0.05)。定心胶囊治疗组的疗效优于维拉帕米对照组(P<0.05)。结论:定心胶囊组能够明显改善房颤大鼠心肌组织中Ca^(2+)-ATP酶及Cx40基因表达。说明益气养阴活血中药对房颤有一定的治疗作用。

脑梗死患者外周血中Cx40基因多态性与粥样斑块性质发展变化的相关性

目的:研究脑梗死患者外周血中缝隙连接蛋白40(Cx40)基因多态性与粥样斑块性质发展变化的相关性。方法:选择2015年3月~2018年3月期间因急性脑梗死在西安医学院第二附属医院就诊的患者作为脑梗死组,选择同期体检的健康者作为对照组。采集外周血并测定Cx40基因rs35594137位点的多态性,采集血清并测定细胞因子、蛋白酶及其相关分子的含量。结果:脑梗死组患者外周血中Cx40基因AA+AG基因型的构成比高于对照组,GG基因型的构成比低于对照组;脑梗死组患者血清中IL-17、HMGB1、VCAM1、MCP-1、P-selectin、YKL-40、MMP9、TIMP1、Caspase-3的含量以及MMP9/TIMP1的比值均显著高于对照组,ADAMTS13、Vaspin的含量均显著低于对照组;脑梗死组中CX40基因AA+AG基因型患者血清中IL-17、HMGB1、VCAM1、MCP-1、P-selectin、YKL-40、MMP9、TIMP1、Caspase-3的含量以及MMP9/TIMP1的比值均显著高于GG基因型患者,ADAMTS13、Vaspin的含量均显著低于GG基因型患者。结论:脑梗死患者外周血中Cx40基因rs35594137位点等位基因G向A突变会促进粥样斑块性质的发展变化。