缝隙连接蛋白43经典与非经典作用在疾病治疗中的潜在价值

背景:缝隙连接蛋白43在维持组织代谢稳态平衡中发挥着重要作用,传统观点认为它参与了缝隙连接过程,为细胞与细胞之间建立直接的物质信号交换通道奠定结构基础。而近年来研究对于其独特的半通道作用提出了新的看法,并发现了其亚细胞定位、自身片段等对于细胞生理活动及病理过程的重要意义。目的:综述数据库中相关文献,系统性总结缝隙连接蛋白43分子特征及在多种细胞表达的研究进展,重点阐述通道依赖性与非通道依赖性缝隙连接蛋白43的生理与病理作用,并探讨其在疾病治疗中的潜在价值。方法:分别设置“gap junction,connexin 43(Cx43),hemichannel,channel-dependent Cx43,channel-independent Cx43,extracellular vesicles(EVs),mitochondria,GJA1-20k”为英文关键词,以“缝隙连接,缝隙连接蛋白43,半通道,通道依赖性Cx43,非通道依赖性Cx43,线粒体,细胞外囊泡,GJA1-20k”为中文关键词,分别在PubMed数据库及中国知网数据库进行文献检索,最终共入选81篇文献进行综述分析。结果与结论:(1)缝隙连接蛋白43的经典作用即构成缝隙连接通道,通道依赖性缝隙连接蛋白43主要可通过直接构成缝隙连接通道参与组织器官的生理或病理过程,应充分关注其结构和功能的完整性,而黏附是缝隙连接的重要特性,与屏障障碍类疾病密切相关。(2)缝隙连接蛋白43的非经典作用即非缝隙连接通道依赖性作用,缝隙连接蛋白43六聚体目前被发现定位于质膜、线粒体内膜和细胞外囊泡表面等结构,参与炎性疾病的正向促炎机制、线粒体功能代谢和细胞外囊泡的靶向摄取等,选择性截短片段则参与全长连接蛋白43靶向转运至胞内各结构域过程,并且通过促使线粒体周围肌动蛋白聚合,调控线粒体稳态。(3)以上两种作用为开发靶向治疗药物及基于组织工程技术的治疗手段中种子细胞转化机制等问题的解决提供了新思路,但现存的一些原始研究常不能全面考虑不同形式缝隙连接蛋白43的相互作用,从而混杂地描述了其总体特征,使得研究结果产生偏差。(4)未来研究需要系统地构架不同形式存在的缝隙连接蛋白43的生理特性及在各疾病中的潜在机制,为缝隙连接蛋白43完整性机制探索及多疾病的诊断和治疗提供参考依据。

益心定悸方对缺血性心律失常大鼠微RNA-1及其调控蛋白缝隙连接蛋白43的影响

目的探究益心定悸方对缺血性心律失常大鼠微RNA-1(miRNA-1)及其调控蛋白缝隙连接蛋白43(Cx43)的影响。方法将60只雄性SPF级10周龄体重(250±20)g的SD大鼠采用随机数字表法分为六组,假手术组,模型组,普萘洛尔对照组,益心定悸方低、中、高剂量组,每组10只。动物喂养1周后,实施灌胃处理。益心定悸方低、中、高剂量组给予13.95、27.90、55.80 g/(kg·d)益心定悸方,普萘洛尔对照组给予普萘洛尔(9.5 mg/7 ml),每天灌胃5 mg/kg,模型组和假手术组灌胃等量生理盐水,l次/d,每组均处理2周。除假手术组外,其余各组灌胃结束后立即造模,通过左冠状动脉前降支结扎,构建大鼠缺血性心律失常模型,假手术组只开胸不结扎。造模后采集大鼠心肌组织,采用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测miRNA-1与Cx43的表达量及Cx43在Ser262和Ser368位点的磷酸化水平。结果与假手术组比较,模型组miRNA-1表达量升高,Cx43表达量减少(P<0.05);与模型组比较,益心定悸方低、中、高剂量组miRNA-1表达量降低,益心定悸方中、高剂量组Cx43表达量升高(P<0.05);与益心定悸方低、中剂量组比较,益心定悸方高剂量组miRNA-1表达量降低,Cx43表达量升高(P<0.05)。与假手术组比较,模型组的Cx43在位点Ser262和Ser368的磷酸化修饰水平降低(P<0.05);与模型组比较,益心定悸方高剂量组的Cx43在位点Ser262和Ser368的磷酸化修饰水平升高(P<0.05);与益心定悸方低剂量组比较,益心定悸方高剂量组的Cx43在位点Ser262和Ser368的磷酸化修饰水平升高(P<0.05);益心定悸方高剂量组的Cx43在位点Ser262和Ser368的磷酸化修饰水平与益心定悸方中剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。苏木精-伊红结果显示,益心定悸方高剂量组可减轻缺血再灌注引起的心肌细胞损伤。结论益心定悸方可能通过下调心肌组织miRNA-1表达量,减弱Cx43的转录后抑制程度,从而有效纠正Cx43的表达。本研究对益心定悸方的药理学做了初步探索,对缺血性心律失常的有效防治提供了理论支撑。

TGF-β1对大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白43介导缝隙连接通讯功能的影响

目的:观察转化生长因子TGF-β1对成年大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白Cx43表达以及由Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能的影响,旨在探讨TGF-β1对Leydig细胞的影响是否与其改变细胞间GJIC功能相关。方法:将原代培养纯化的Leydig细胞分为6组:实验组分别以1、2、5、10 ng/ml的TGF-β1处理细胞20 h,空白对照组以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液处理细胞,部分实验中以GJIC抑制剂甘珀酸(Carbenox-olone)处理细胞作为阳性对照组。采用免疫荧光法和Western印迹观察Cx43在细胞中的定位和表达变化,用荧光漂白恢复实验(FRAP)检测细胞间GJIC功能的改变。结果:Cx43表达呈斑点状散在分布于Leydig细胞的胞质和胞膜中,TGF-β1处理20 h后,Cx43在胞质中的表达强度随着TGF-β1浓度的增加较空白对照组明显增强,而其在胞膜中的表达则无明显改变。Western印迹结果显示磷酸化状态的Cx43随着TGF-β1浓度增加表现出较空白对照明显增强的趋势(P<0.05),而非磷酸化状态则无显著差异。FRAP结果显示经5 ng/ml TGF-β1作用20 h后细胞内荧光强度较空白对照明显减弱,具有显著性差异(P<0.01),且其平均荧光恢复率仅为(43.58±1.87)%。结论:TGF-β1可显著下调Leydig细胞间的GJIC功能,这种抑制作用可能通过增加其连接蛋白Cx43在细胞质中的表达,提高其磷酸化水平来实现。

特异性阻断Kv1.5通道对心房颤动患者缝隙连接蛋白40表达的影响

目的利用伊布利特特异性阻断超速延迟整流性钾通道(Kv1.5)后对缝隙连接蛋白(Cx)40表达的影响,探讨Kv1.5通道可能是心房肌缝隙连接蛋白下游信号传导通路之一,揭示心房颤动(AF)的可能发生机制。方法实验标本取自风湿性心脏病接受心脏瓣膜置换手术患者的右心耳组织,根据患者术前心律将标本分为2组:风湿性心脏病[窦性心律组(SR组)]和风湿性心脏病合并AF组(AF组)。采用酶解法分离风湿性心脏病接受手术患者心房肌细胞、培养心房肌细胞和运用Western blot技术检测两组心房肌细胞运用伊布利特特异性阻断Kv1.5通道前后Cx40的表达情况。结果利用伊布利特特异性阻断Kv1.5通道后,AF组患者心房心肌细胞Cx40的表达水平较阻断前明显增加(P<0.01);而在SR组中,阻断前后Cx40/GAPDH比值的变化不明显。结论 Kv1.5通道的开放状态可能会影响Cx40的表达,从而揭示AF的发生机制中电重构可能会引起结构重构。

猪缝隙连接蛋白43(GJA1)结构和功能的预测与分析

为了探究猪缝隙连接蛋白43(GJA1)的结构和相关功能,本研究对16个哺乳动物的GJA1蛋白进行多重序列比对及系统发育分析,并通过相关的生物信息学数据库和软件从理化性质、蛋白修饰位点、跨膜区、亚细胞定位、二级结构、三级结构、多态位点、功能区域和互作蛋白等方面对猪GJA1蛋白的结构和功能进行系统分析。系统发育分析结果显示,GJA1蛋白在16种哺乳动物中变异未达到饱和,物种间遗传距离小且同源性高,其中猪与马的GJA1蛋白序列最为接近,同源性达93.3%,在进化树上的分类也证实了这一结果。蛋白结构分析结果显示,猪GJA1蛋白分子质量为43.08ku,理论等电点为8.88,由20种氨基酸组成,不稳定指数为44.06,平均疏水系数为-0.240,脂溶指数为82.67,不分泌信号肽,有4个跨膜区、6个O-糖基化位点和38个磷酸化位点,最有可能位于细胞质膜和高尔基体内,其二级结构和三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。蛋白功能分析结果显示,在猪GJA1蛋白的CDS序列中有2个超级家族结构功能区域和6个错义突变位点,且猪GJA1蛋白还与ZO-1和Cx36等蛋白及多种蛋白激酶存在相互作用。本研究通过生物信息学分析系统地揭示了猪GJA1蛋白的结构和功能,为后续进一步研究GJA1蛋白在猪体内发挥生物学功能的遗传调控机制提供一定的理论支持。

TGF-β1/Smad通路在血管紧张素Ⅱ下调缝隙连接蛋白43表达中的作用

目的:分析心肌梗死(MI)后心脏组织中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、缝隙连接蛋白43(Cx43)和转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad通路相关因子的变化情况,以探讨AngⅡ能否经由TGF-β1/Smad调节Cx43的表达。方法:采用左前降支冠状动脉(LAD)结扎建立大鼠心肌梗死模型后,20只SD雄性大鼠随机分为氯沙坦(20 mg·kg^(-1)·d^(-1))治疗组与MI组,分别于结扎后及治疗2周后检测心功能情况,并检测治疗2周后左室心肌组织不同区域AngⅡ、AngⅡ1型受体(AT1)、Cx43以及TGF-β1/Smad通路相关分子的变化情况。结果:氯沙坦组左室舒张末期内径(LVIDd)和左室收缩末期内径(LVIDs)明显缩小(P<0.01),室间隔厚度(IVSd)及左室后壁厚度(LVPWd)明显减小(P<0.05),左室射血分数(LVEF)显著增加(P<0.01);梗死区和边缘区的AngⅡ水平明显降低;梗死区AT1表达显著降低;Cx43在心肌组织不同区域表达增高,TGF-β1、Smad 2、Smad 3在心肌组织不同区域表达均降低,而Smad 7表达增高。结论:心肌梗死后AngⅡ激活可能通过作用于TGF-β1/Smad通路导致Cx43表达下调。

抑制小鼠HL-1心肌细胞桥粒斑蛋白基因表达对缝隙连接蛋白43结构和功能的影响

目的:采用基因沉默技术抑制小鼠HL-1心肌细胞桥粒斑蛋白(DSP)基因表达以明确DSP与缝隙连接蛋白43(Cx43)的结构和功能关系。方法:用基因沉默技术抑制DSP基因的表达,Western blotting和流式细胞术检测HL-1细胞DSP和Cx43蛋白的表达,用双免疫荧光方法检测DSP与Cx43蛋白的表达与定位情况,并用划痕标记染料示踪技术检测细胞缝隙连接通讯状况。结果:与空白组和对照组相比,siRNA-DSP组的DSP和Cx43蛋白表达量降低(P<0.05)。免疫荧光检测发现空白组和对照组DSP与Cx43蛋白存在共定位情况,而siRNA-DSP组DSP和Cx43蛋白共定位遭到破坏,Cx43蛋白出现再分布,在细胞内检测到Cx43蛋白,并且划痕标记染料示踪技术检测发现siRNA-DSP组Lucifer yellow通过HL-1细胞缝隙连接的传输功能降低。结论:DSP表达抑制不仅使Cx43出现再分布,而且影响缝隙连接传导功能。

转化生长因子-β_1对大鼠心房纤维化和缝隙连接蛋白40重构的影响

目的:采用大鼠心房纤维化的模型,探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对大鼠心房纤维化和缝隙连接蛋白(Cx)40重构的影响及阿托伐他汀的防治作用。方法:将30只雄性Wistar大鼠随机等分为对照组(A)、盐酸异丙肾上腺素组(B)、盐酸异丙肾上腺素+阿托伐他汀组(C)。8周后处死,Masson染色法测大鼠心房纤维化程度,免疫组化法显示大鼠心肌组织TGF-β1和Cx40分布特征,并半定量统计分析。rt-PCR测大鼠心肌组织中Cx40mRNA表达情况。结果:与A组相比,B组大鼠心肌组织TGF-β1含量显著升高(P<0.01),心房纤维化程度增加,Cx40含量显著减少(P<0.01),且分布紊乱;与B组相比,C组大鼠心肌组织中TGF-1β含量减少(P<0.05),心房纤维化程度明显减轻,Cx40含量升高(P<0.05),分布基本恢复正常;与A组相比,C组大鼠各指标均无明显变化(P>0.05)。结论:心肌组织中TGF-β1含量增加可能是心房纤维化和Cx40重构的机制之一;阿托伐他汀可通过降低心肌组织中TGF-β1含量显著改善心房纤维化程度和Cx40重构。

内皮素-1及缝隙连接蛋白43在心律失常发生中的作用

近几年研究表明,内皮素-1(ET-1)和缝隙连接蛋白43(Cx43)与心律失常的发生有密切关系。ET-1的受体或Cx43可能是预防心律失常发生的新的药理学靶点。本文就ET-1和Cx43与心律失常关系的研究进展作一综述。

蛋白酶活化受体1活化或抑制对鼻咽癌细胞迁移侵袭及缝隙连接蛋白43表达的影响

背景与目的:蛋白酶活化受体1(protease-activated receptor 1,PAR1)在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用,其在鼻咽癌中的作用机制尚不清楚。本文旨在检测PAR1活化或抑制对鼻咽癌细胞(CNE1-LMP1)增殖及侵袭的影响,并初探其机制。方法:选取高表达PAR1的CNE1-LMP1细胞系作为研究对象,首先采用四甲基偶氮唑盐(MTT)、划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测PAR1特异性激动肽SFLLRN和特异性抑制剂SCH79797对CNE1-LMP1细胞增殖、迁移和侵袭的影响。然后应用实时定量PCR(real-time PCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测PAR1活化及抑制前后缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)mRNA及蛋白表达情况,并比较组间表达差异。结果:与CNE1-LMP1细胞未处理组相比,PAR1特异性激动肽SFLLRN能够促进CNE1-LMP1细胞增殖、迁移和体外侵袭,同时发现Cx43 mRNA和蛋白量明显减少(P<0.05)。与CNE1-LMP1细胞未处理组相比,PAR1抑制剂SCH79797能明显抑制CNE1-LMP1细胞增殖、迁移和体外侵袭,并且发现Cx43 mRNA和蛋白量明显增高(P<0.05)。结论:活化PAR1能够促进鼻咽癌细胞系CNE1-LMP1的增殖、迁移和侵袭,减少Cx43 mRNA和蛋白表达,而抑制PAR1的表达能抑制鼻咽癌细胞系CNE1-LMP1的增殖、迁移和侵袭,增加Cx43 mRNA和蛋白表达。

缝隙连接蛋白pannexin1在神经病理性疼痛大鼠脊髓背角的表达变化

目的观察缝隙连接蛋白pannexin1(PX1)在坐骨神经分支选择结扎模型大鼠脊髓背角上的表达变化。方法健康SD雄性大鼠50只,分为对照组(WT组,n=10)、假手术组(sham组,n=10)和坐骨神经分支选择性损伤组(SNI组,n=30)。SNI组20只大鼠于术后3、5、7、14d(n=5),WT、sham组于术后14d(n=5)取脊髓腰段用Western blot法检测PX1表达变化,另20只大鼠于术后7d取脊髓腰段进行免疫组化染色,检测脊髓背角内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达水平。SNI组中10只于建模前进行鞘内置管,术后7d分别向鞘内注射生理盐水20μL(SNI+NS组)或甘珀酸(CBX)20μL(SNI+CBX组),再进行免疫组化染色。结果 SNI组脊髓背角内PX1表达增多,并随时间增强,明显高于WT、sham组(P<0.05);7d后SNI组脊髓背角内GFAP表达较WT、sham组明显增强(P<0.05);SNI+CBX组GFAP表达较SNI+NS组明显下调(P<0.05)。WT、sham组脊髓背角的PX1蛋白和GFAP表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论缝隙连接蛋白PX1可能参与了星形胶质细胞的激活,提示其在因外周神经损伤引起的神经病理性痛中起重要作用。

SHP-1在Ang-(1-7)拮抗AngⅡ致心房肌缝隙连接蛋白43重构中的作用

目的探讨血管紧张素1-7[angiotensin 1-7,Ang-(1-7)]是否通过SHP-1来抑制血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的c-Src激活,从而改善缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)的表达以及功能。方法以小鼠心房肌细胞系(HL-1细胞系)作为研究对象,分为Control组、AngⅡ组、AngⅡ+SU6656(c-Src抑制剂)组、AngⅡ+Ang-(1-7)组、AngⅡ+Ang-(1-7)+SSG(SHP-1抑制剂)组,Western blot分别检测p-c-Src、Cx43、SHP-1的表达,细胞免疫荧光、划痕标记染料示踪技术观察Cx43空间分布以及缝隙连接功能。结果与Control组比较,高浓度AngⅡ(10-6mol/L)干预后p-c-Src表达增加(P<0.01),Cx43表达降低(P<0.05),Cx43传导距离缩短;SU6656和Ang-(1-7)预处理可抑制AngⅡ诱导的c-Src激活,Cx43表达增加(P<0.05),Cx43传导距离增加;同时Ang-(1-7)预处理明显地促进SHP-1的表达增加(P<0.05)。与AngⅡ+Ang-(1-7)组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)+SSG组SHP-1表达降低(P<0.05),p-c-Src表达增加(P<0.01),细胞Cx43表达降低(P<0.05),Cx43传导距离缩短。结论Ang-(1-7)通过增加SHP-1表达从而抑制c-Src活性,进而发挥对AngⅡ的拮抗作用,使Cx43表达上升并改善缝隙连接功能。

细胞缝隙连接蛋白43、自噬相关基因Beclin-1表达水平与甲状腺癌患者TNM分期的相关性研究

目的探究细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)、自噬相关基因Beclin-1表达水平与甲状腺癌患者TNM分期的相关性。方法选取2011年5月至2017年4月许昌市人民医院术后确诊的125例甲状腺癌患者,68例甲状腺良性疾病患者,因其他原因进行手术或甲状腺活检的42例甲状腺组织正常者,均行Cx43、Beclin-1免疫组化染色检测。比较不同甲状腺组织中Cx43、Beclin-1表达水平,并分析Cx43、Beclin-1表达水平与甲状腺癌患者TNM分期的相关性。结果甲状腺癌组织中Cx43、Beclin-1阳性表达率低于甲状腺良性病变组织、正常甲状腺组织,差异有统计学意义(P <0. 05)。甲状腺癌患者TNMⅠ+Ⅱ期Cx43阳性表达率高于Ⅲ+Ⅳ期,差异有统计学意义(P <0. 05)。Cx43与甲状腺癌患者TNM分期呈负相关(P <0. 05);自噬相关基因Beclin-1与甲状腺癌患者TNM分期无关(P> 0. 05)。结论 Cx43表达与甲状腺癌患者TNM分期呈负相关,自噬相关基因Beclin-1与甲状腺癌患者TNM分期无关。

紧密连接蛋白ZO-1、occludin和actin参与缺氧缺血诱导的血脑屏障通透性增加

目的探讨血脑屏障紧密连接(blood-brain barrier-tight junction,BBB-TJ)蛋白ZO-1、occludin和ac-tin在缺氧缺血诱导的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性增加中的变化及其机制。方法利用人脐静脉内皮细胞系ECV304与星形胶质细胞(astrocytes,AS)共培养建立体外BBB模型,模型随机分为正常对照组和缺氧缺血两组。透射电镜观察两组间BBB-TJ的变化,直接免疫荧光观察细胞骨架蛋白actin分布的改变。γ计数仪检测大分子物质125I-牛血清白蛋白(125I-BSA)通透曲线观察BBB通透性的改变,Western blot检测细胞骨架蛋白actin,胞浆附着蛋白ZO-1,跨膜蛋白occludin的表达量的改变。结果透射电镜观察培养第10天的体外BBB模型,可见内皮细胞连接紧密,细胞间形成光滑、连续、较高密度的紧密连接。缺氧缺血后5 h,内皮细胞间连接开放,形成裂隙。直接免疫荧光下检测可见周边Actin丝带模糊,部分断裂,形成细胞间裂隙。缺氧缺血组125I-BSA的通透量增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。同时ZO-1的表达量显著减少,而occludin和actin的表达量无明显改变。结论缺氧缺血诱导occludin的位置分布改变和ZO-1的表达量减少进而促使actin蛋白发生重排,是导致缺氧缺血后BBB通透性增加的可能机制之一。

紧密连接蛋白ZO-1研究概述

紧密连接(tight junction,TJ)是维持粘膜上皮机械屏障和通透性的重要结构。紧密连接蛋白ZO-1是其重要组成蛋白之一,不但参与调节细胞物质转运和维持上皮极性,而且还与细胞增殖分化、肿瘤细胞转移、基因转录等过程的信息传递和调控有关。本文就ZO-1蛋白分子的结构及主要功能作一综述,旨在对其在各种功能中的具体作用有所了解。

食管鳞状细胞癌中紧密连接蛋白occludin、ZO-1的表达及其临床意义

目的探讨紧密连接蛋白occludin及ZO-1在食管鳞状细胞癌及手术切缘正常食管黏膜组织中的表达及其临床意义。方法采用组织芯片和免疫组化法检测49例食管鳞状细胞癌患者的癌组织及手术切缘正常食管黏膜组织(距肿瘤组织>5 cm)中occludin和ZO-1的表达,分析食管鳞状细胞癌癌组织中occludin、ZO-1表达与肿瘤的增殖、侵袭和转移之间的关系。结果食管鳞状细胞癌组织中occludin及ZO-1的阳性表达明显低于手术切缘正常食管粘膜组织(P<0.01),且癌组织中occludin、ZO-1的表达与其分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05)。结论食管鳞状细胞癌的occludin和ZO-1的表达下调或缺失与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有关,在食管癌的进展中起重要作用。

缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注后紧密连接的保护作用及ZO-1蛋白表达的影响

目的观察缺血后处理对脑缺血再灌注后紧密连接的保护作用及相关蛋白ZO-1表达的影响。方法 45只Wistar雄性大鼠随机分为假手术(Sham)组、缺血再灌注(I/R)组、缺血后处理(IP)组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型,脑缺血2 h后,I/R组予再灌注,IP组给予缺血后处理之后予再灌注。于脑缺血再灌注后24 h行TTC染色观察脑梗死体积,应用电镜观察紧密连接蛋白结构改变,Western blot观察ZO-1蛋白表达的变化。结果 IP组脑梗死体积明显小于I/R组,与Sham组相比,I/R组血脑屏障紧密连接开放,ZO-1蛋白表达明显减少;与I/R组比较,IP组紧密连接开放程度减轻及ZO-1表达增加。结论缺血后处理减小脑梗死体积;缺血后处理能够减轻紧密连接破坏,其保护机制可能与ZO-1蛋白表达增加有关。

紧密连接ZO-1蛋白在缺血性脑卒中肠黏膜改变的意义

目的研究缺血性脑卒中时是否存在肠黏膜屏障改变以及紧密连接蛋白Zonula Occluden-1(ZO-1)在其中的可能机制。方法杂犬20只,随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组用双硅柱法制作缺血性脑卒中模型。实验前、实验后0.5、3、6、12、24h行血浆二胺氧化酶(DAO)活性和D-乳酸(D-lac)浓度检测;光镜下对肠黏膜病理形态进行观察;免疫组化法分析肠黏膜ZO-1蛋白的表达。结果和对照组比较,实验组24hDAO、12h和24hD-lac明显增高(24h DAO:0.5512±0.1057比0.3822±0.0789;12hD-lac:6.2249±1.2683比4.3342±0.7900;24hD-lac:8.4581±1.7416比4.4766±0.9486;P<0.01);实验组ZO-1蛋白平均光密度(OD)明显降低(0.1989±0.0118比0.2224±0.0150;P<0.01)。相关和回归分析显示,血浆24hDAO与24h、12h、6hD-lac呈正相关关系(γ分别为0.787、0.8117、0.862,P<0.01);ZO-1蛋白OD与24hDAO、24hD-Lac呈负相关(γ分别为-0.8385、-0.7088,P=0.002、0.022),光镜下观察,实验组存在小肠病理损伤,对照组小肠结构正常。结论血浆DAO活性和D-lac能有效反映缺血性脑卒中时肠屏障损伤。肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1在缺血性脑卒中时表达降低,这是肠屏障功能障碍的重要分子机制之一。

淫羊藿苷对阿尔茨海默病大鼠模型金属蛋白酶及紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

目的探讨淫羊藿苷对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)大鼠学习记忆、海马区基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2及血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达的影响。方法采用Aβ1-42海马注射建立AD大鼠模型,使用淫羊藿苷进行干预。以Morris水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力,采用Western-blot法分析紧密连接蛋白ZO-1的表达,用免疫组织化学法检测大鼠海马区MMP-9、MMP-2表达。结果与对照组相比,AD模型组大鼠学习记忆能力明显减退,ZO-1表达明显减少(P<0.05),MMP-9、MMP-2蛋白明显增加;淫羊藿苷干预后,大鼠学习记忆能力均明显提高,海马区MMP-9/MMP-2表达减少(P<0.05),ZO-1表达明显增加(P<0.05),以淫羊藿苷高剂量干予后明显。结论淫羊藿苷能通过抑制MMP-9/MMP-2表达,减轻血脑屏障破坏,从而改善AD症状。

EMAP-Ⅱ对紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1相互作用的调节和机制

目的研究内皮—单核细胞激活多肽Ⅱ(EMAP-Ⅱ)对血肿瘤屏障(BTB)紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1分布和相互作用的影响,以及蛋白激酶C(PKC)活性的变化,探讨PKC在EMAP-Ⅱ开放紧密连接中的作用。方法提取和培养大鼠脑微血管内皮细胞,建立体外BTB模型;实验分为7组,即模型组、EMAP-Ⅱ0.5 h组、EMAP-Ⅱ1 h组、EMAP-Ⅱ2 h组、EMAP-Ⅱ3h组、EMAP-Ⅱ6 h组和EMAP-Ⅱ12 h组。应用Milicell-ERS系统检测体外BTB模型跨内皮细胞阻抗值的变化;双重免疫荧光检测内皮细胞中紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的分布和定位;免疫共沉淀检测内皮细胞中occludin和ZO-1的结合水平;PKC活性检测试剂盒检测体外BTB模型内皮细胞中总PKC的活性。结果与模型组相比,EMAP-Ⅱ显著降低了体外BTB模型的跨内皮细胞阻抗值,增加了BTB通透性;在模型组,紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1在内皮细胞边缘呈连续分布,并且二者存在共定位,EMAP-Ⅱ能够使occludin和ZO-1在内皮细胞边缘的分布减少,二者的共定位减弱;免疫共沉淀结果也显示EMAP-Ⅱ能够减弱occludin和ZO-1的结合;上述作用在EMAP-Ⅱ作用1 h时效果最显著(P<0.01);同时发现EMAP-Ⅱ作用后,BTB模型内皮细胞中PKC的活性显著升高,在EMAP-Ⅱ作用1 h时达峰值(P<0.01)。结论 EMAP-Ⅱ能够调节紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1在内皮细胞的相互作用,开放紧密连接;PKC可能是EMAP-Ⅱ影响occludin和ZO-1相互作用、调节紧密连接的机制之一。