缝隙连接蛋白26突变导致遗传性耳聋的研究进展

缝隙连接蛋白26(Cx26)是耳蜗中最丰富的缝隙连接蛋白之一,由GJB2基因编码,对耳蜗的发育与听力形成至关重要,Cx26突变患者可表现出不同程度的听力损失。学界曾普遍认为钾离子循环障碍是引起耳聋的主要机制,但近年的研究发现GJB2基因突变相关听力损失中的钾离子循环障碍与耳蜗的病理表型并不直接相关,而耳蜗的发育障碍与氧化应激系统在其中起着关键作用。文章总结了Cx26突变引起相关听力损失的病理生理机制,包括钾离子循环障碍、内耳发育障碍、氧化应激系统失衡等。阐明Cx26突变导致听力损失的病理机制有助于开发针对遗传性耳聋的预防和治疗策略。

缝隙连接蛋白26与肿瘤关系的研究进展

缝隙连接蛋白(Connexin,Cx)是一种介导细胞间信息交流与物质交换的跨膜蛋白,其功能和表达的改变[如异常表达、亚细胞定位改变及缝隙连接细胞间通讯(Gap junction intercellular communication,GJIC)缺失]常参与多种肿瘤的发生发展。缝隙连接蛋白26(Connexin 26,Cx26)是缝隙连接蛋白家族的重要成员,与癌症的关系复杂。在不同肿瘤组织中,Cx26以GJIC依赖性或GJIC非依赖性作用发挥抑癌或促癌作用。此外,Cx26与多种肿瘤预后相关,具有作为肿瘤预后标志物及抗肿瘤治疗靶点的巨大潜力。本文对Cx26与多种肿瘤的关系及机制进行综述,为Cx26作为抗肿瘤治疗的干预靶点提供思路。

缝隙连接蛋白26基因修饰对人高转移性肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨缝隙连接蛋白(Cx)26基因对人高转移性肝癌细胞株(HCCLM3)细胞增殖和侵袭能力的影响。方法采用慢病毒载体(LV)转染法将载体LV-Cx26转染高转移性HCCLM3细胞为研究组,仅转染空载体LV-NC-Cx26为对照组,未转染的HCCLM3细胞为空白组。RTPCR和Western印迹测定转染后Cx26 mRNA和蛋白表达;划痕荷载染料传输实验检测细胞通讯功能;流式细胞术检测细胞周期并通过CCK-8增殖实验、Transwell细胞侵袭实验检测细胞增殖、侵袭能力。结果研究组Cx26 mRNA和蛋白表达量均明显高于对照组和空白组(P<0.05)。研究组转染慢病毒载体LV-Cx26后的细胞通讯功能明显强于对照组、空白组,即划痕细胞中的荧光染料可传递到相邻的3~4列细胞。研究组G0/G1期细胞数明显多于对照组和空白组,S期细胞数明显少于对照组和空白组(P<0.05)。M期三组细胞数无统计学差异(P>0.05)。CCK-8法检测显示,72 h起研究组细胞增殖速度明显低于同期对照组和空白组(P<0.05);对照组和空白组各时间点细胞增殖情况无统计学差异(P>0.05)。Transwell细胞侵袭实验显示,研究组穿膜细胞数明显少于对照组和空白组(P<0.05)。结论转染Cx26基因可有效抑制HCCLM3细胞的增殖和侵袭能力,降低恶性生物学特征,可成为晚期肝癌治疗的新思路。

缝隙连接蛋白26和30在大鼠2型糖尿病性耳聋模型中的表达

目的探讨缝隙连接蛋白(Cx)26和Cx30在大鼠2型糖尿病耳蜗中的表达,及两者在2型糖尿病性耳聋发病机制中的作用。方法60只Wistar大鼠随机分为实验组(40只)和对照组(20只);实验组以腹腔注射10 mg/L链脲佐菌素建立2型糖尿病模型,检测模型成功前及成功后第1、2、3、4、5月的听性脑干反应(ABR),采用HE染色观察两组耳蜗形态变化;免疫荧光、Western blotting检测Cx26和Cx30在两组大鼠耳蜗的表达变化。结果实验组在模型成功后第1、2、3、4、5月Click-ABR 60dBSPLⅢ波、Ⅴ波潜伏期和Ⅰ~Ⅲ、Ⅰ~Ⅴ波间期较对照组延长(P<0.05);实验组螺旋韧带和螺旋神经节中细胞数量少于对照组(P<0.05);实验组Cx26和Cx30在成模后2、3、4、5月表达较对照组减少(P<0.05),且随着时间延长,两种蛋白表达逐渐降低。结论Cx26和Cx30在大鼠2型糖尿病模型耳蜗中表达减少,且与听力损害出现时间相同。

缝隙连接蛋白connexin 26基因条件性敲除小鼠血管纹超微形态研究

目的观察不同年龄缝隙连接蛋白26(Connexin 26,Cx26)基因条件性敲除小鼠血管纹的超微病理形态学改变,探索Cx26突变的致聋机制。方法将Cx26 loxP/loxP与foxg1-cre转基因小鼠进行杂交,获得Cx26条件基因敲除小鼠模型(Foxg1-Cre cCx26ko条件性敲除小鼠,简称为cCx26ko小鼠),与野生型小鼠(wild type,WT)进行对比。分离出小鼠耳蜗标本,先制作半薄切片定位,再行超薄切片,采用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察血管纹细胞的超微病理改变。结果血管纹各种细胞在早期未见异常;出生后120天(postnatal day 120,P120)起细胞内出现溶酶体增多,P180天见巨大吞噬细胞,P360天见色素颗粒。结论 Connexin 26基因条件性敲除小鼠出生后早期血管纹超微形态基本正常。成年转基因动物的血管纹出现超微病理学改变,推测其与细胞异常代谢和衰老有关,这可能是Cx26突变致聋的病理机制之一。

缝隙连接蛋白26和核转录因子κB在三阴性乳腺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达及临床意义

目的:探讨缝隙连接蛋白26(connexin 26,Cx26)和核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)病人原发灶和淋巴结转移灶中的表达及临床意义。方法:回顾性收集经术后病理和分子分型确诊为TNBC的存档石蜡组织,原发灶共49例,其中无区域淋巴结转移者22例(A1组),有区域淋巴结转移者27例(A2组);将27例淋巴结转移灶作为B组。应用免疫组织化学SP染色法,检测各组中Cx26和NF-κB的表达情况,并分析二者表达的相互关系及其与临床病理特征的相关性。结果:原发灶中A2组Cx26和NF-κB阳性表达率均高于A1组(P<0.01和P<0.05);转移灶B组Cx26和NF-κB阳性表达率均高于原发灶A1组(P<0.01)。Cx26蛋白表达与TNBC病人绝经状态、淋巴结转移有关(P<0.01),NF-κB表达与pTNM分期、淋巴结转移有关(P<0.01和P<0.05)。在淋巴结转移灶中,Cx26与NF-κB表达呈明显正相关关系(r=0.663,P<0.01)。结论:Cx26和NF-κB共同参与TNBC的浸润和转移,可作为预测TNBC转移复发及评估临床预后的有效指标。

细胞缝隙连接对miR-124抗肿瘤作用的影响和机制研究

目的 探讨不同连接蛋白(connexin,Cx)组成的缝隙连接(gap junction,GJ)对miR-124抗肿瘤作用的影响及机制。方法 在稳定转染表达Cx26或Cx32的Hela细胞(Hela26、Hela32),以及稳定转染shRNA-Cx43的人胶质瘤U87细胞(U87 shRNA-Cx43 )中,应用Western blot和荧光示踪实验分别测定Cx表达和GJ功能;集落形成实验检测miR-124对细胞增殖影响;膜片钳检测Cy3荧光标记的miR-124在细胞间的传递。结果 多西环素可诱导Hela26和Hela32细胞上Cx表达和GJ形成;miR-124抑制Hela细胞增殖,但在有GJ(Dox诱导)和无GJ形成(无Dox诱导)条件下统计学上无明显差异。相较于U87 shRNA-NC ,U87 shRNA-Cx43 细胞中Cx43表达、GJ功能及miR-124的增殖抑制作用均明显降低;显微镜下可见导入到“供体细胞”中的荧光miRNA逐渐布满整个细胞并传递到相邻非“导入”细胞内。结论 GJ可影响miR-124的抗肿瘤作用,但具有Cx异质性。相较Cx26或Cx32,Cx43组成的GJ可调控miR-124的抗肿瘤作用,这可能与该GJ通道对miR-124的传递作用较强有关。

抗GFP纳米抗体为亲和配基纯化缝隙连接蛋白26

[目的]以表达纯化的抗GFP纳米抗体为亲和配基制作免疫亲和层析柱纯化缝隙连接蛋白26(Cx26),为其他与GFP融合表达的膜蛋白的纯化提供新的思路。[方法]用大肠杆菌表达镍柱纯化抗GFP纳米抗体,以其为亲和配基Sepharose 4B琼脂糖为亲和介质,制作抗GFP纳米抗体免疫亲和层析柱,并用其纯化Cx26-GFP融合蛋白。通过激光共聚焦显微镜和荧光尺寸排阻色谱法(FSEC)检测层析柱与Cx26-GFP融合蛋白的结合能力、稳定性;SDS-PAGE凝胶电泳、尺寸排阻色谱法(SEC)观察目的蛋白Cx26的纯度及均一性。[结果]抗GFP纳米抗体免疫亲和层析柱在激光共聚焦显微镜下呈现圆形、无色、直径约30~80μm的琼脂糖球,与Cx26-GFP融合蛋白结合后琼脂糖球发出绿色荧光。过柱前的溶膜后上清和过柱后的流穿液1经FSEC分析显示,两个样品均在洗脱体积11.5 mL时出现Cx26-GFP融合蛋白峰,流穿液1在此位置处的峰高比溶膜后上清降低了86%。柱上酶切过夜去除GFP标签后的流穿液2经SEC分析显示洗脱体积15 mL时出现左半峰高耸右半峰增宽的Cx26蛋白峰;峰尖处收集管液经SDS-PAGE凝胶电泳分析在25 kDa附近观察到Cx26蛋白条带。[结论]表达纯化的抗GFP纳米抗体有生物学活性,以此制备的抗GFP纳米抗体免疫亲和层析柱可稳定结合Cx26-GFP融合蛋白并纯化出杂质少、性状均一的Cx26蛋白。

慢病毒靶向干扰Cx26抑制人高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖及迁移

目的探讨缝隙连接蛋白26(connexin 26,Cx26)对人高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。方法构建Cx26干扰慢病毒载体感染HCCLM3细胞,用嘌呤霉素筛选稳定干扰Cx26表达的靶细胞,通过Realtime PCR和Western blot鉴定Cx26的mRNA和蛋白表达情况;用"parachute"荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;用MTT法、流式细胞术、Transwell迁移实验分别检测干扰Cx26对HCCLM3细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。结果 LV-Cx26组的Cx26 mRNA和蛋白表达明显低于LV-NC组和野生组细胞(P<0.01),并且LV-Cx26组的GJ功能也较LV-NC组和野生组明显减弱(P<0.01)。干扰Cx26可明显抑制HCCLM3细胞增殖(P<0.01),促进HCCLM3细胞凋亡(P<0.01),降低其体外迁移能力(P<0.01)。结论慢病毒靶向干扰Cx26表达可明显减弱其GJ功能,并抑制高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移能力,促进凋亡,降低其恶性生物学特性。

肝再生磷酸酶-3上调缝隙连接蛋白26诱导结肠癌LoVo细胞间质上皮化

目的探讨在结肠癌肝转移的肿瘤微环境中肝再生磷酸酶-3（PRL-3）对缝隙连接蛋白26（Cx26）的影响及促进结肠癌细胞间质上皮化（MET）的机制。方法将稳定转染PRL-3的LoVo细胞（LoVo-P）、对照组（LoVo-c）分别和肝细胞（1．02）模拟肿瘤微环境进行体外共培养0～3d后，Westernblot检测Cx26、上皮标志物E-钙黏蛋白（E—cadherin）和间质标志物N-钙黏蛋白（N—cadherin）的蛋白表达。Transwell侵袭小室法检测LoVo细胞侵袭能力变化。采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶（sP）法检测20例Ⅳ期结肠癌及肝转移灶中Cx26和E-cadherin的表达。结果Westernblot检测结果显示，LoVo-P细胞经共培养后Cx26的蛋白表达分别上升31．03％、58．39％、93．95％（P〈0．05），E—cadherin蛋白表达明显上升，N．cadherin蛋白表达受到抑制（P〈0．05），对照组中蛋白表达变化不明显。经过共培养后LoVo-P细胞侵袭能力明显降低（P〈0．05）。免疫组织化学结果显示，Cx26和E-cadherin在肝转移灶中的阳性表达率（65％和75％）高于原发灶（40％和45％），差异有统计学意义（P〈0．05）。在结肠癌肝转移灶中Cx26和E．cadherin呈正相关（r：0．545，P〈0．05）。结论在共培养环境中PRL-3能通过上调Cx26诱导LoVo细胞MET并降低其侵袭能力。

慢病毒介导shRNA靶向下调Cx26表达对人高侵袭性肝癌细胞上皮间质转化及侵袭的影响

目的探讨慢病毒介导shRNA靶向下调缝隙连接蛋白26(Cx26)表达对人高侵袭性肝癌细胞上皮间质转化(EMT)及侵袭的影响。方法用慢病毒介导Cx26-shRNA感染SK-Hep-1细胞并用嘌呤霉素筛选稳转细胞。荧光定量PCR和Western blot检测干扰效率。光镜观察细胞形态改变。Western blot检测EMT上皮标志物E-cadherin、间质标志物vimentin的蛋白表达水平。Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。结果成功建立稳定下调Cx26表达的SK-Hep-1细胞(shRNA-Cx26组),与感染EGFP空载体(shRNA-control组)及未感染的SK-Hep-1细胞(blank-control组)比较,其Cx26 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.01),间质细胞形态转变为上皮细胞形态,E-cadherin蛋白表达明显增多、vimentin蛋白表达明显减少(P<0.01),体外侵袭能力也显著降低(P<0.01)。结论靶向下调Cx26表达能抑制人高侵袭性肝癌SK-Hep-1细胞的EMT和体外侵袭。

Cx26缺陷遗传性耳聋病理机制的研究进展

GJB2基因编码的缝隙连接蛋白26(Connexin26,Cx26)是耳蜗中最重要的一种缝隙连接蛋白(Cx),在耳蜗缝隙连接(Gap Junction,GJ)中高度表达。Cx26是最常见和危害人群最广的耳聋基因,该基因缺陷不仅导致先天性耳聋,也可引起迟发性耳聋。早前人们推测Cx26突变引起耳聋的原因可能是Cx26缝隙连接功能障碍致耳蜗内淋巴液K+循环障碍。近些年来研究发现,Cx26缺陷耳聋主要是因为耳蜗发育障碍致先天性耳聋,耳蜗主动放大障碍致迟发性耳聋。本文就近年来Cx26缺陷先天性耳聋和迟发性耳聋病理机制的研究进展予以综述。

Connexin26基因与常染色体隐性非综合征性耳聋

已知所有的常染色体隐性非综合征性耳聋 (ARNSHL)基因可致重度或极重度学语前耳聋 ,目前已有 32个 ARN-SHL 基因 ,通过对单一的有血缘关系的家系分析而定位。其中编码缝隙连接蛋白 2 6的 Connexin2 6 (Cx2 6 )基因突变与 ARN-SHL 关系最为密切。同时 Cx2 6基因突变也是 DFNA3/ DFNB1的遗传基础。有关 Cx2 6基因突变及其产生异常缝隙连接蛋白在听觉功能中的作用尚不清楚 ,本文综合目前对 Cx2

恢复connexin26表达联合载酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因纳泡杀灭膀胱癌细胞

目的分析载双基因的阳离子纳泡联合超声靶向微泡破坏技术进行基因转染的有效性,探索恢复或上调膀胱癌细胞的缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)表达,能否增强自杀基因系统(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine,YCD/5-FC)的旁观者效应,提高杀灭肿瘤细胞的效率。方法阳离子纳泡结合超声辐照(US)转染人膀胱癌T24细胞,荧光显微镜及流式细胞仪观测转染效率;qRT-PCR和Western blot检测质粒转染后的mRNA或蛋白相对表达量。将实验分为无处理空白对照、载pc DNA3.1-EGFP纳泡组、载Cx26纳泡组、载YCD纳泡组、载YCD+Cx26纳泡组;通过流式细胞术观察恢复Cx26表达后对膀胱癌细胞凋亡的影响。结果 qRT-PCR、Western blot显示纳泡结合超声辐照成功将目的基因转染并有效表达。恢复Cx26表达后,载YCD+Cx26纳泡组的细胞凋亡率为(60.68±2.61)%,明显高于单载YCD纳泡组的(46.42±2.13)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论恢复缝隙连接蛋白Cx26表达,可改善细胞间通讯连接,加强自杀基因系统YCD/5-FC的旁观者效应,促进肿瘤细胞凋亡,提高杀灭膀胱癌细胞的效率。

缝隙连接蛋白26缺陷聋的神经细胞中缝隙连接蛋白的表达差异

目的:通过诱导多能干细胞(iPSCs)技术获得缝隙连接蛋白26(Cx26)缺陷聋患儿的神经细胞,研究Cx26缺陷对神经细胞发育和基因表达的影响。方法:从3例Cx26缺陷造成的极重度耳聋患儿取得成纤维细胞,将之诱导为数个非整合iPSC细胞系,鉴定这些细胞系的形态和内源性、外源性基因表达。然后将这些细胞系向神经细胞方向分化,检测整个过程中形态、多能性基因、神经标记物、缝隙连接蛋白基因表达变化。结果:能够成功建立Cx26缺陷的3个iPSC细胞系,并且可以在体外分化为神经前体细胞和神经元细胞;这些细胞的形态、增殖、内源性、外源性基因表达与人胚胎干细胞基本一致;iPSC细胞系分化出的神经元细胞中,Cx32的表达明显上调,Cx36的表达略微上调,Cx26的表达没有明显变化。结论:Cx26缺陷不影响诱导多能干细胞的神经分化,但其过程中Cx32和Cx36表达上调,提示Cx32可能对Cx26缺陷发挥了代偿作用。

缝隙连接蛋白26对小鼠噪声易感性的影响

目的探讨降低耳蜗缝隙连接蛋白26(connexin 26,Cx26)表达对暴露于噪声环境中小鼠噪声易感性的影响。方法条件诱导性Cx26基因敲除新生小鼠32只,随机分为空白组、他莫昔芬(tamoxifen,TMX)组、噪声组、噪声+TMX组各8只,TMX组于出生第18天给予单次TMX(1.5 mg/10g)皮下注射;噪声组于出生第24天开始暴露于100dB声压级(sound pressure level,SPL)稳态白噪声中,每日连续8h,持续7d;噪声+TMX组于出生第18d天给予单次TMX(1.5mg/10g)皮下注射,出生第24天开始暴露于100dB SPL稳态白噪声中,每日连续8h,持续7d;空白组不作处理。分别于实验前(出生第15天)、实验结束后(出生第30天)检测4组小鼠宽带短声(Click)及频率为8、16、32kHz短声听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)的反应阈;实验结束后处死小鼠,迅速断头取出双侧耳蜗,Western blot法检测Cx26蛋白表达。结果 4组实验前Click及8、16、32kHz频率短声ABR反应阈比较差异均无统计学意义(P>0.05);噪声+TMX组实验结束后Click[(42.08±5.42)dB SPL]及8、16、32kHz频率短声ABR反应阈[(47.08±5.82)、(62.92±9.16)、(84.58±4.98)dB SPL]均高于噪声组[(29.38±4.03)、(40.63±6.80)、(39.06±7.35)、(56.25±12.45)dB SPL]、TMX组[(21.50±5.80)、(28.50±4.74)、(25.50±4.97)、(37.50±7.17)dB SPL]、空白组[(24.58±5.82)、(28.33±6.51)、(29.17±3.59)、(39.17±8.75)dB SPL](P<0.05),且噪声组高于TMX组和空白组(P<0.05),TMX组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05);实验结束后耳蜗Cx26蛋白表达在噪声+TMX组(0.710±0.175)、噪声组(0.774±0.157)、TMX组(0.851±0.087)均低于空白组(1.117±0.114)(P<0.05),噪声+TMX组、噪声组、TMX组耳蜗Cx26蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论降低耳蜗Cx26蛋白表达可增加小鼠对噪声的易感性。

CIH致聋仔鼠内耳Cx26与Cx30蛋白的表达研究

目的研究宫内缺氧对仔鼠内耳听力损伤影响及内耳缝隙连接蛋白26(Cx26)和缝隙连接蛋白30(Cx30)蛋白的表达影响。方法建立宫内慢性缺氧(CIH)孕鼠模型,16只SD孕大鼠分为正常组和缺氧组,每组8只。仔鼠出生后8周,听性脑干反应(ABR)检测后再分2个亚组:正常仔鼠组、缺氧耳聋仔鼠组(各12只)。动脉血气分析各组孕鼠和仔鼠动脉血氧分压(PaO_2)和血氧饱和度(SaO_2),免疫荧光染色、蛋白质印迹法检测仔鼠内耳Cx26和Cx30蛋白表达水平。结果缺氧组孕鼠与正常组比较,PaO_2和SaO_2均显著下降(P<0.05),但比较两组孕鼠的PaCO_2、pH值,无统计学意义(P>0.05)。缺氧耳聋仔鼠组内耳组织Cx26和Cx30蛋白的表达水平明显低于正常仔鼠组(P<0.01)。结论缺氧耳聋仔鼠耳蜗组织Cx26和Cx30蛋白表达明显低于正常仔鼠,提示CIH致聋可能与Cx26和Cx30表达下降有关。

人GJB2基因错义突变表达载体构建及鉴定

目的构建6种分别携带GJB2基因错义突变A40G、V37I、L90P、L90V、V84L和W44C的真核表达载体,转染HEK293细胞,建立6种错义突变的稳定表达细胞系。方法以野生型Cx26-EGFP融合蛋白质粒为模板,用Stratagene公司定点突变试剂盒构建错义突变表达载体,直接测序鉴定序列正确性,选取含有突变的载体转染HEK293细胞,G418选择性培养2周,流式细胞仪筛选表达阳性细胞,扩增培养形成稳定表达人Cx26突变的HEK293细胞系。培养细胞用4%多聚甲醛固定,鬼笔环肽和4',6-二脒基-2-苯基吲哚衬染细胞核,荧光显微镜下检测结果。结果6种突变表达载体经过测序,均含有相应突变,无多余突变出现,转染后均可在细胞间形成缝隙连接,呈现绿色荧光。结论成功构建6种携带GJB2基因错义突变的真核表达载体,为进一步研究错义突变致聋原因奠定了实验基础。

GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗外毛细胞凋亡时程观察

目的探讨GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗毛细胞缺失方式和具体时间。方法 GJB2基因条件敲除小鼠cCx26loxp/loxp-Pax2-Cre(cCx26)由转基因小鼠Cx26loxp/loxp与Cx26loxp/--Pax2-Cre小鼠杂交获得,分别选取P8、P14、P18和P21四个发育阶段各6只小鼠进行实验。野生型BALB/c小鼠作为正常对照。常规解剖出耳蜗基底膜,鬼笔环肽-FITC及碘化丙啶(PI)分别染色、铺片,激光共聚焦显微镜观察、拍照。结果与野生型小鼠相比,cCx26小鼠P8时耳蜗外毛细胞纤毛、细胞核形态均未见明显异常改变;P14时,鬼笔环肽染色显示耳蜗中回表皮板疏松,外毛细胞纤毛染色开始不规则,PI染色外毛细胞核排列极性欠佳,细胞核着色不均匀,可见深染的胞核,尚未见明显的外毛细胞缺失;P18时,鬼笔环肽染色显示表皮板出现区域性的模糊和单个外毛细胞纤毛的消失,外毛细胞核出现皱缩、片断化,甚至缺失,这一改变以中回最为明显,底回次之,顶回改变最轻微;P21时,表皮板出现了片状缺失,外毛细胞丢失明显,残余细胞排列紊乱。与野生型小鼠相比,cCx26ko小鼠各阶段内毛细胞纤毛染色不规则,深浅不一,细胞核未见明显形态异常及缺失。结论 GJB2基因缺失可引起小鼠耳蜗Corti器表皮板破损以及外毛细胞的凋亡,表皮板及外毛细胞纤毛的变化开始于P14,P18时外毛细胞出现典型的凋亡表现。

GRP78/Bip在GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗中的表达

目的研究GRP78/Bip在GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗中的表达,探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与非综合征型聋的相关性。方法敲基因小鼠(6只)Cx26loxp/loxp;Pax2 Cre/+(cCx26)为实验组,野生型BALB/c小鼠(6只)为正常对照组,两组分别选取P8、P12和P21小鼠各2只进行实验。采用耳蜗冰冻切片,免疫组化法检测耳蜗切片中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein,GRP78)的表达。结果 cCx26小鼠耳蜗的GRP78/Bip表达定位与对照组相同,但在P8和P12时cCx26小鼠耳蜗表达更强,到P21时,在盖膜、耳蜗外侧壁GRP78/Bip表达较对照组减弱,而在顶回仅存的不成熟Corti细胞团中,GRP78/Bip表达与对照组接近。结论 GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗发育成熟之前,其耳蜗中GRP78/Bip表达增高,ERS可能参与了GJB2基因突变导致的非综合征型聋的发生过程。