连续3步缺口修复技术构建牛αS1酪蛋白-人溶菌酶杂合基因座

目的:构建一个牛αS1酪蛋白调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列的杂合基因座。方法:采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术。将6个无痕连接的同源臂插入以pBR322为载体的骨架中,构成能进行3次连续基因抓捕的载体,利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,分别抓捕牛αS1酪蛋白3'端调控序列(9 kb)、hLYZ基因座序列(5 kb)、牛αS1酪蛋白5'端调控序列(20 kb),使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成牛αS1酪蛋白-hLYZ杂合基因座。结果:实验经过PCR扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定,验证了hLYZ的基因组序列对牛αS1酪蛋白编码基因组序列的精确置换。结论:这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法。