改进dUTP缺口末端标记技术法的操作体会

通过对多种石蜡组织切片运用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)法检测细胞凋亡,在进行前期处理、冲洗、减少非特异性染色、蛋白酶K消化时间、显色、复染、封片等方面总结了一定经验。

肝癌组织中p27^(KIP1)基因的表达及其与细胞凋亡的关系

目的:探讨p27KIP1与肝细胞癌的发生发展及其凋亡的关系.方法:利用免疫组织化学方法检测52例肝细胞肝癌组织中p27KIP1的表达,同时采用DNA缺口末端标记技术(TUNEL)检测凋亡细胞.结果:p27KIP1在癌旁肝组织中的阳性细胞指数(10.7±7.6)明显高于在癌组织中的阳性细胞指数(1.5±0.9,P<0.01).并且在包膜受侵犯者(1.4±0.76vs1.8±0.3,P<0.01)、肝内转移者(1.2±0.2vs1.5±0.4,P<0.05)及低分化的肝癌组织(1.9±0.7vs1.4±0.4,P<0.01)中p27KIP1蛋白表达明显降低.进一步的研究发现,肝癌组织中高AI(apoptosisindex)组的p27KIP1阳性细胞指数(1.7±0.6)明显高于低AI组(1.4±0.3,P<0.05).结结论论:p27KIP1基因的低表达与HCC的浸润、转移及恶性程度有着密切的联系.并且肝癌细胞的凋亡与p27KIP1基因的表达有关.

胎盘滋养层细胞的感染和凋亡与HBV的宫内传播机制

目的:通过HBV感染体外培养的人绒毛膜滋养层细胞,探讨HBV宫内感染发生的机制.方法:对人早孕绒毛膜滋养层细胞进行原代培养和对人滋养层细胞系JEG-3进行传代培养,将HBV感染血清与原代及传代培养细胞共同孵育8-48h,倒置显微镜观察细胞形态及细胞间连接,细胞免疫荧光和免疫组织化学染色方法检测滋养层细胞中HBsAg和HBcAg的表达,荧光定量PCR方法检测被感染的滋养层细胞中的HBV DNA,TUNEL方法检测滋养层细胞的凋亡.结果:与HBV阳性血清共同孵育对滋养层细胞的形态和细胞间连接无明显影响;细胞免疫荧光和免疫组织化学染色结果显示,滋养层细胞与HBV感染血清共同孵育(8,24,48h)后,滋养层细胞可以出现HBsAg和HBcAg的阳性表达,24 h时HBsAg阳性细胞数量最多(8h:18.0%±3.67%;24h:30.6%±2.88%;48 h:24.8%±4.21%);荧光定量PCR方法检测到被感染的滋养层细胞中HBV DNA的存在;TUNEL结果显示,与HBV感染血清共同孵育可导致滋养层凋亡细胞数量逐渐增加(24h:18.6%±3.05%;48h:26.8%±2.86%:P<0.01).结论:滋养层细胞的感染可能是HBV通过胎盘屏障的途径之一;HBV感染可以诱导滋养层细胞产生凋亡,这可能是胎盘屏障阻止HBV宫内感染的一种保护性机制.

ASPP2及P16^(INK4a)在食管癌中的表达及其与凋亡的关系

目的探讨ASPP2、P16^(INK4a)在食管癌的表达与患者临床病理特征及凋亡的相关性。方法 SP免疫组化染色法检测112例食管癌及31例正常食管黏膜ASPP2、P16^(INK4a)的表达,分析它们与患者临床病理特征的相关性;在上述蜡块中随机选取37例食管癌及12例正常食管黏膜,采用原位缺口末端标记技术(TUNEL)检测上皮细胞的凋亡情况,分析凋亡阳性率与以上二标记物在食管癌表达的相关性。结果 ASPP2、P16^(INK4a)在食管癌与正常食管黏膜的表达差异有统计学意义,且二者异常表达均与食管癌组织学分级、淋巴结转移相关(P<0.05)。TUNEL检测显示正常食管黏膜与食管癌的凋亡阳性率差异有统计学意义,且其与ASPP2、P16^(INK4a)在食管癌的表达相关(P<0.05)。结论 ASPP2、P16^(INK4a)参与食管癌发生、发展及凋亡等过程,联合检测二者可辅助食管癌诊断并指导临床治疗。

大鼠肺移植供肺保存过程中细胞死亡类型的动态变化

目的通过对供肺保存过程中细胞凋亡和细胞坏死的动态变化的研究,探讨建立一种可以准确评估供肺保存质量的实验模型。方法清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠42只,体重250～300g,预先分为7组,每组6只。整体获取心肺,置于4℃的新鲜制备的低钾右旋糖酐（LPD）溶液中保存。保存不同的时间（0、2、4、6、12、18、24h）后,通过主肺动脉向肺内灌注20mL的500mmol/L锥虫蓝、20mL生理盐水和10mL4%的多聚甲醛后固定,蜡块包埋后按4μm层厚切片。在光学显微镜下观察锥虫蓝染色情况;另一方面作TUNEL染色和Hoechst染色,在荧光显微镜下观察,严格按照盲法原则由两位研究者对死亡细胞进行分类计数。结果随着供肺低温保存时间的延长,细胞死亡数量上逐渐增加,而且细胞的死亡类型上发生动态变化。在低温保存的条件下,4h组才开始有少量的坏死细胞出现,随着保存时间的逐渐延长,细胞坏死也逐渐增加,在供肺保存18h以上组,坏死细胞显著增加;而细胞的凋亡开始于供肺保存2h组,在供肺保存12h组达到高峰,约占所有细胞的9%,在供肺保存18h组基本消失。结论通过对不同保存时间的供肺进行锥虫蓝、TUNEL、Hoechst三染色的方法,能很好的显示供肺保存后的细胞凋亡和坏死的情况。

不同舌苔舌上皮细胞的凋亡及相关基因分子机理研究

目的探讨不同舌苔舌上皮细胞凋亡及其相关基因表达的关系。方法运用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端标记技术、原位杂交、免疫组化和图像分析技术,检测常见舌苔舌上皮细胞凋亡及凋亡相关基因bax、fas、TGF-β3mRNA和蛋白产物。结果4种常见舌苔其舌上皮细胞均可见细胞凋亡发生,不同舌苔变化趋势与凋亡指数变化趋势相反。与正常及薄苔比较,剥苔bax、fas基因过度表达伴随细胞凋亡增多,而厚苔bax、TGF-β3mRNA低表达伴随细胞凋亡减少。舌苔上皮细胞中促凋亡基因bax、fas、TGF-β3表达水平变化趋势与细胞凋亡水平变化趋势一致。结论凋亡相关基因bax、fas、TGF-β3表达水平的变化可能是影响舌苔上皮细胞凋亡,并导致不同舌苔变化的重要原因。

大肠癌和腺瘤中的细胞凋亡及其调控基因表达

据《中华病理学杂志》1997年6月26卷第3期报道 天津医科大学病理学教研室孙保存等,通过观察结、直肠腺癌和腺瘤中的细胞凋亡及其调控基因p53、bcl-2的表达状态,探讨了细胞凋亡及其调控基因在大肠上皮恶性转化进程中不同阶段的作用。利用DNA缺口末端标记技术和P53、bcl-2蛋白免疫组化染色。