白花草木樨结瘤缺失型突变体的结瘤表型及生物量分析

为研究草木樨共生固氮的形成机制,以白花草木樨野生型Ma389经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变后的Ma58、Ma61和Ma62结瘤缺失型突变体为材料,接种苜蓿中华根瘤菌SM1021后对其结瘤表型和生物量进行了分析。结果表明:突变体Ma58、Ma61不形成侵染线和根瘤原基,突变体Ma62不形成侵染线,且只形成少数不固氮的白色小根瘤。3种突变体在低氮基质中生长30 d时,根鲜/干质量显著低于野生型(P<0.05),从40 d开始,地上部鲜/干质量、根鲜/干质量、株高和根长均显著低于野生型(P<0.05),在富氮基质中则无显著差异,表明这3种突变体的突变基因只与共生固氮相关,为草木樨共生固氮机制研究奠定了遗传材料基础。

肝细胞癌组织中HBx基因缺失型突变体真核表达载体的构建和鉴定

目的构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体。方法以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含KpnⅠ和ApaⅠ酶切位点的HBx基因片段。双酶切后再与载体pcDNA3载体重组连接。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后,经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体。结果成功构建了重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体,经DNA序列测定与比对,重组前后HBx基因片段序列一致。结论pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体构建成功,可为HBx基因缺失型突变体,特别是HBx-d382基因的生物学功能研究提供基因材料。

HBx基因缺失型突变体QSG7701细胞转染模型的建立与鉴定

目的建立稳定表达乙型肝炎病毒X基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431蛋白QSG7701肝细胞株。方法HBx-d382和HBx-d431基因经PCR和双酶切后,插入到真核表达载体pcDNA3中,构成重组质粒pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431。应用基因转染的方法,将重组质粒分别转染到QSG7701肝细胞中,经G418筛选和RT-PCR、蛋白印迹鉴定,筛选出稳定表达HBx蛋白的细胞株。结果经PCR、酶切及序列鉴定,重组质粒pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431构建成功。RT-PCR和Western blot结果显示,该重组质粒能在QSG7701肝细胞中表达插入的HBx-d382和HBx-d431基因编码的融合蛋白。结论成功建立了稳定表达羧基端截短的HBx蛋白肝细胞株HBx-d382和HBx-d431。HBx-d382和HBx-d431肝细胞模型的建立,为HBx-d382和HBx-d431基因及其蛋白的深入研究奠定了基础。

HBx基因缺失型突变体对肝细胞QSG7701细胞增殖和凋亡的影响

目的研究HBx-d382和HBx-d431缺失型突变体对永生化QSG7701肝细胞生物学行为的影响。方法采用HE染色法,观察转染细胞形态学变化,通过MTT、软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪及裸鼠成瘤实验研究稳定转染细胞的生物学特性。结果与转染空质粒pcDNA3相比,转染肝癌组织中HBx-d382和HBx-d431突变体及HepG2.2.15细胞株中HBx-2215基因的QSG7701细胞大小形态不一致、体积增大、核浆比例增大,生长速度更快,克隆形成率高(P<0.05)。与转染空质粒pcDNA3S期百分比(29.4%)和凋亡率(13.1%)比较,pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-2215组细胞S期百分比比例增高,分别为32.8%和35.0%,pcDNA3/HBx-d431组凋亡率下降(4.5%)。结论 HBx-d382和HBx-d431缺失型突变体能促进QSG7701细胞增殖和恶性转化。

HBx基因缺失型突变体HBx-d382与HBx-d431原核表达载体的构建和鉴定

目的为探讨HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431在临床上应用的价值,构建HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431原核表达载体。方法以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的HBx基因片段。HBx基因PCR扩增产物与载体pET-28a(+)经双酶切、连接,形成重组DNA后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经卡那霉素筛选、酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组HBx基因缺失型突变体原核表达载体。结果成功构建了重组pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)HBx-d431原核表达载体,重组前后HBx基因片段序列一致。结论pET-28a(+)/HBx-d382和pET-28a(+)/HBx-d431原核表达载体构建成功,为HBx基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431蛋白的免疫原性和临床应用的研究奠定了基础。

组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂缺失突变体治疗兔视网膜静脉阻塞的疗效

目的在兔视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion,RVO)模型上研究组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂缺失突变体(reteplase,r-PA)的溶栓效果,并与重组人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂(recombinant tissue-type plasminogen activator,rt-PA)对照,评价两种溶栓药物在静脉应用的疗效。方法光化学法诱导45只兔RVO模型(45只眼),分别静脉注射r-PA(15只眼)、rt-PA(15只眼)和注射用水(15只眼,对照组),4 h后观察血管再通情况,检测溶栓相关血液指标。结果给药后4h,r-PA组与rt-PA组静脉完全再通率分别为77.33%和为66.67%,无统计学意义;两者与对照组比较,完全再通率有统计学意义(P<0.001)。在给药后rt-PA组血浆凝血酶时间较r-PA组延长,血浆纤维蛋白原较r-PA组下降,且有统计学意义。结论静脉注射r-PA对兔RVO模型有治疗效果,疗效与rt-PA无明显区别,r-PA对凝血和纤溶系统的影响比rt-PA小。