鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

猪IL-2与IL-6的原核表达及其对伪狂犬病基因缺失疫苗的佐剂效应研究

将猪白细胞介素2(pIL-2)与猪白细胞介素6(pIL-6)的cDNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a及pGEX-KG上,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导产生重组蛋白pIL-2与pIL-6,表达量分别占菌株总蛋白的43.45％和28.37％,经提纯后含量可分别达到97.06％和86.37％。将提纯后不同剂量的两种重组蛋白以单独或组合的方式,加入伪狂犬病(Ea株)TK^-/gG^-双基因缺失疫苗中,使每头份疫苗分别含2、5和10μg·ml^(-1)的pIL-2或(和)pIL-6,用此疫苗免疫伪狂犬病抗体阴性猪。同时设试验对照组。初次免疫30d后加强免疫,测定中和抗体,观察试验猪的日增重情况,进行统计分析。发现各试验组的抗体水平均高于不含重组蛋白的基因缺失疫苗组;其中,含2μg·ml^(-1)pIL-2试验组与含10μg·ml^(-1)pIL-2/pIL-6试验组抗体水平和基因缺失疫苗对照组之间呈显著差异(P=0.019)与极显著差异(P=0.009)。结果表明,大肠杆菌表达的pIL-2、pIL-6对伪狂犬病鄂A株基因缺失疫苗(TK^-/gG^-/LacZ^+)有较强的佐剂效应,且呈剂量相关性。不同试验组日增重比较结果表明,免疫效果高低与猪的生长速度呈正相关。本试验为重组pIL-2与pIL-6作为新型疫苗佐剂应用提供了重要的试验依据。

猪口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗不同首免日龄对免疫效果影响测定

为评价猪口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗不同首免时间对免疫效果的影响,选择二组不同日龄试验猪只进行免疫接种,接种疫苗当天采集试验猪血样测定母源抗体水平,并分别在首免和二免后不同间隔时间采集血样,分别用口蹄疫液相阻断ELISA和非结构蛋白抗体ELISA方法检测猪O型、A型口蹄疫抗体和非结构蛋白抗体水平。结果显示:40日龄首免的猪只,一免后31 d,A型和O型口蹄疫抗体阳性率分别为94.12%和100%,二免后60 d,分别为31.58%和36.84%;70日龄首免的猪只,一免后30 d,A型和O型口蹄疫抗体阳性率均为100%,二免后54 d,均为97.96%。表位缺失疫苗免疫后,两个试验猪群口蹄疫非结构蛋白抗体均为阴性。结果表明:70日龄首免的猪群,其口蹄疫O型和A型抗体阳性率较同期40日龄首免的猪群高,说明母源抗体水平低的仔猪对该疫苗的免疫应答水平更高。

口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗免疫安全性和抗体消长规律研究

为摸清口蹄疫0型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗免疫安全性和抗体消长规律,对试验猪群进行免疫,观察其健康状况,采用口蹄疫非结构蛋白ELISA检测非结构蛋白抗体,采用液相阻断ELISA检测0型和A型口蹄疫抗体。结果显示,疫苗免疫后,猪群健康状况良好,各时间点口蹄疫非结构蛋白抗体均为阴性;免疫前、一免后29 d、61 d、95 d、123 d,二免后30 d、64 d、92 d,A型口蹄疫抗体阳性率分别为7.14%、100%、100%、100%、100%、100%、100%和100%,0型口蹄疫抗体阳性率分别为0、100%、100%、100%、100%、100%、100%和100%。表明该疫苗免疫猪只后,安全性好,不会诱导动物机体产生口蹄疫非结构蛋白抗体,诱导产生的高水平A型、0型口蹄疫抗体可以维持较长时间,实施一免可维持至少4个月,实施二免可维持至少3个月。