附子人参不同配伍比例对缺糖缺氧/复糖复氧损伤大鼠心肌细胞的保护作用

目的观察不同配伍比例的附子人参对缺糖缺氧/复糖复氧损伤大鼠心肌细胞的保护作用。方法将原代培养6 d的心肌细胞分为正常对照组、模型组、不同配伍比例的附参组、空白血清组。建立原代大鼠心肌细胞缺糖缺氧/复糖复氧损伤模型,观察不同配伍比例的附子人参血清对损伤心肌细胞自发搏动、细胞活力的作用,并测定心肌细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量以及心肌组织上清液中一氧化氮(NO)分泌量和乳酸脱氢酶(LDH)释放率。结果与空白血清组比较,各附参配伍组心肌细胞自发搏动频率、细胞活力显著升高(P<0.05),心肌细胞SOD活性显著升高(P<0.05),MDA含量、NO分泌量和LDH释放率均显著降低(P<0.05),而且附参(2∶1)组对心肌细胞的自发搏动频率、细胞活力、SOD、MDA和LDH作用均不同程度地优于其余各配伍组。结论各附参配伍组对缺糖缺氧/复糖复氧损伤大鼠心肌细胞具有保护作用,其中以附参(2∶1)组作用效果最为显著。

匹诺塞林对缺糖缺氧/复糖复氧损伤SH-SY5Y细胞内钙离子及Caspase-12表达的影响

目的探讨匹诺塞林对缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)损伤SH-SY5Y细胞的细胞内钙离子([Ca^(2+)]i)变化及Caspase-12表达的影响。方法SH-SY5Y细胞制备OGD/R损伤模型,缺糖缺氧2 h,复糖复氧12 h,荧光探针法检测细胞胞质内钙信号变化,免疫荧光检测细胞内Caspase-12表达。结果OGD/R损伤可使SH-SY5Y[Ca^(2+)]i升高,Caspase-12表达增加,匹诺塞林能降低OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的[Ca^(2+)]i,减少Caspase-12的表达。结论匹诺塞林能减轻OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤,作用机制可能与其降低[Ca^(2+)]i,减少Caspase-12表达有关。

匹诺塞林对缺糖缺氧/复糖复氧SH-SY5Y细胞内质网应激凋亡通路相关蛋白的影响

目的探讨匹诺塞林脑保护的作用机制。方法采用SH-SY5Y细胞制备OGD/R损伤模型,缺糖缺氧2 h、复糖复氧12 h,采用MTT法检测细胞活力及LDH释放,细胞核Hoechest33324染色检测细胞凋亡,免疫荧光检测细胞内GRP78、CHOP、P-eIF2α及ATF4表达的变化。结果匹诺塞林能提升OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的活力,减少LDH释放,提高GRP78表达,降低CHOP、ATF4及P-eIF2α的表达。结论匹诺塞林能减轻缺糖缺氧/复糖复氧诱导的SH-SY5Y细胞损伤,可能与其调节ERS凋亡途径的PERK-eIF2α-ATF4通路相关蛋白表达有关。

MiR-199a修饰的间充质干细胞来源外泌体通过Akt/HIF-1α/DRP1轴促进缺糖缺氧/复糖复氧模型心肌细胞H9c2线粒体修复

目的 探讨miR-199a修饰的间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体修复缺糖缺氧/复糖复氧模型心肌细胞H9c2线粒体的作用机制。方法体外培养MSCs,转染miR-199a mimics或miR-NC, 48~72 h后收集外泌体,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测外泌体的miR-199a水平。将H9c2细胞分为对照组、模型组、miR-199a修饰外泌体(Exos^(mimic),终质量浓度50μg·mL^(-1))组、miRNA阴性对照修饰外泌体(Exos^(NC),终质量浓度50μg·mL^(-1))组和miR-199a修饰外泌体+蛋白激酶B(Akt)抑制剂(Exos^(mimic)+MK2206 10μg·mL^(-1))组,除对照组外,制备缺糖缺氧/复糖复氧模型。应用CCK-8法检测各组细胞存活率,酶标仪检测各组细胞三磷酸腺苷(ATP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平以及上清液8-羟基脱氧尿苷(8-OHdG)、乳酸脱氢酶(LDH)水平;共聚焦显微镜检测各组线粒体膜电位(ΔΨm)和线粒体动力学变化;Western blotting法检测各组缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和线粒体动力相关蛋白1(DRP1)蛋白表达变化。结果 与对照组比较,Exos^(mimic)中miR-199a表达水平明显升高(P<0.05),提取的外泌体直径平均为109.3 nm,浓度为1×10^(6)颗粒·mL^(-1)。与对照组比较,模型组细胞存活率和ATP、SOD、ΔΨm水平显著下降,LDH、MDA、8-OHdG水平和HIF-1α和DRP1蛋白表达水平显著升高(P<0.01、0.001),线粒体分裂水平增加;与模型组比较,Exos^(mimic)组细胞存活率和ATP、SOD和ΔΨm水平显著升高,LDH、MDA、8-OHdG水平和HIF-1α及DRP1蛋白表达水平显著下降(P<0.01、0.001),线粒体分裂水平减少;MK2206能明显逆转Exos^(mimic)效果(P<0.05、0.01)。结论 miR-199a修饰的MSCs外泌体通过Akt/HIF-1α/DRP1轴促进缺糖缺氧/复糖复氧心肌细胞线粒体修复。

小檗碱下调NLRP3减轻PC12细胞缺氧缺糖/复氧复糖损伤的作用

目的探讨小檗碱通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路降低神经元焦亡的作用机制。方法以大鼠PC12培养细胞构建缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)诱导的细胞模型,实验分组为正常对照组、OGD/R损伤组、小檗碱低、高剂量组。MTT检测细胞活性(LDH)、TUNEL法检测细胞凋亡、免疫荧光检测GSDMD表达、酶联免疫法检测IL-1β及IL-18的分泌、Western blotting检测NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表达。结果经小檗碱处理后,与OGD/R损伤组比较:(1)神经元细胞活性明显下降(P<0.01);(2)细胞凋亡减少(P<0.01);(3)GSDMD荧光表达下降(P<0.01);(4)IL-1β及IL-18表达下降(P<0.01);(5)NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表达均有不同程度降低(P<0.01)。结论小檗碱能够抑制OGD/R诱导的神经元细胞损伤,其机制可能为通过NLRP3/Caspase-1信号通路抑制OGD/R诱导的细胞焦亡。

不同浓度补阳还五汤含药血清对缺氧缺糖/复氧复糖损伤的大鼠CTX-TNA2细胞系修复作用观察

目的探讨不同浓度补阳还五汤含药血清对缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)损伤大鼠星形胶质细胞系CTX-TNA2的修复作用。方法将处于对数生长期的CTX-TNA2细胞系分为观察组、血清组、模型组、正常组。正常组不做任何处理,常规培养;模型组弃去原培养基,加入不含糖、含钙镁的无糖培养基6 h(缺氧缺糖处理),然后把无糖培养基全部更换为完全培养基培养24 h(复氧复糖);观察组和血清组细胞缺氧缺糖处理6 h后,分别用含0.5%、1%、3%、5%、10%补阳还五汤含药血清(观察1、2、3、4、5组)或含0.5%、1%、3%、5%、10%空白血清(血清1、2、3、4、5组)的完全培养基培养24 h。采用MTS法检测细胞存活率,LDH法检测细胞乳酸脱氢酶漏出率,倒置相差显微镜观察细胞状态。结果与正常组相比,模型组细胞存活率降低,且乳酸脱氢酶漏出率升高(P均<0.01);与模型组比较,观察组细胞存活率升高(P<0.01)、乳酸脱氢酶漏出率降低(P<0.01);与血清4组比较,观察4组细胞存活率高(P<0.01)、乳酸脱氢酶漏出率低(P<0.05)。观察组细胞的胞体状态和胞间突起较模型组有所恢复,且比血清组细胞好转更显著。结论与其他浓度的补阳还五汤含药血清比较,5%补阳还五汤含药血清可修复CTX-TNA2细胞OGD/R损伤。

匹诺塞林对缺糖缺氧/复糖复氧诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的:研究匹诺塞林对缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法:SH-SY5Y细胞系制备OGD/R损伤模型,缺糖缺氧2 h,复糖复氧24 h。MTT法检测细胞存活率,通过LDH释放率考察细胞活力,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,应用DCFH-DA和MitoSOX分别检测细胞ROS及线粒体超氧化物水平,Western Blot法测定cytochrome c,Bcl-2,Bax,cleaved caspase 3蛋白表达水平,免疫荧光法测定HO-1和Nrf2的表达。结果:OGD/R导致SH-SY5Y细胞存活率显著降低。匹诺塞林(1和10μmol·L-1)能显著增加SH-SY5Y细胞存活率,降低细胞凋亡率。同时,匹诺塞林能够减少OGD/R诱导ROS的释放,减缓线粒体膜电位去极化,促进HO-1蛋白表达及Nrf2核转位,降低OGD/R损伤所致cytochrome c,Bax,cleaved caspase 3的升高,抑制Bcl-2的降低。结论:匹诺塞林能够抑制OGD/R损伤引起的SH-SY5Y细胞氧化应激与线粒体凋亡。

瞬时受体电位M2抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧细胞的保护作用

目的:探讨瞬时受体电位M2(TRPM2)抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧(OGD/R)细胞模型的保护作用。方法:采用SH-SY5Y细胞系制备OGD/R损伤模型。将细胞随机分为空白对照组、模型对照组和A10组。细胞计数试剂盒8检测细胞存活率;活性氧检测试剂盒检测细胞活性氧水平;四甲基罗丹明甲酯法检测线粒体膜电位;一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞数量;蛋白质印迹法测定cleaved caspase 3蛋白表达。结果:相对于3、20、30、50和100μmol/L,10μmol/L浓度的A10具有较低的细胞毒性及较好的通道活性抑制作用。与模型对照组比较,A10组活性氧水平降低(P<0.05),线粒体膜电位降低程度改善(P<0.05),凋亡细胞数减少(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved caspase 3表达减少(P<0.05)。结论:A10可以通过抑制TRPM2通道功能、减少细胞外钙离子内流、降低细胞活性氧水平、稳定线粒体膜电位水平和减少细胞凋亡缓解OGD/R后细胞的损伤。

黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元JNK3的表达

目的观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关蛋白c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N ter-minal kinase 3,JNK3)及其mRNA表达的影响,探讨黄芪注射液防治海马神经元凋亡可能的作用机制。方法取原代培养8d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液组和黄芪溶剂对照组。其中缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液组和黄芪溶剂对照组进行缺氧缺糖0.5h再复氧复糖,并于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72和120h采用Western blot、ELISA和RT-PCR方法检测海马神经元JNK3蛋白及其mRNA的表达。结果缺氧缺糖/复氧复糖组在0、0.5、2、6、24和72h海马神经元JNK3蛋白条带平均光密度值及蛋白活性均较正常对照组增加(P<0.05),而复氧复糖120h组较正常对照组降低(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,除120h之外,黄芪注射液组在各个时间点JNK3蛋白条带的平均光密度值及蛋白活性均降低(P<0.05);而黄芪溶剂对照组与缺氧缺糖/复氧复糖组相比则差异无显著性(P>0.05)。缺氧缺糖/复氧复糖组在0、0.5、2、6、24、72和120h海马神经元JNK3mRNA平均光密度值均较正常对照组增加(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,除120h之外,黄芪注射液组在各个时间点JNK3mRNA的平均光密度值均降低(P<0.05);而黄芪溶剂对照组与缺氧缺糖/复氧复糖组相比则差异无显著性(P>0.05)。结论黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因JNK3mRNA表达,从而抑制JNK3蛋白表达,降低了JNK3蛋白活性,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖引起大鼠海马神经元凋亡的作用。

黄芪有效成分对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元cyt-c、CcO表达的影响

目的观察黄芪有效成分对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元cyt-c及CcO表达的影响,探讨黄芪有效成分防治海马神经元凋亡可能的作用机制。方法取培养8 d的大鼠海马神经元,进行缺氧缺糖0.5 h,再分别复氧复糖0、0.5、2、6、24、72和120 h。实验分4组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。分别采用细胞免疫化学法、Western blot法检测海马神经元cyt-c蛋白的表达、RT-PCR法检测CcO mRNA的表达。结果模型组在各个时间点cyt-c蛋白和CcO mRNA表达均较正常对照组增加(P<0.05);与模型组相比,黄芪有效成分组在各个时间点cyt-c蛋白和CcO mRNA表达均降低(P<0.05),而黄芪注射液溶剂对照组则无变化(P>0.05)。结论黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元cyt-c、CcO的表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖后大鼠海马神经元的凋亡。

黄芪甲苷调控自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡

目的探讨黄芪甲苷通过调控自噬,对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡的影响。方法将HT22细胞随机分为正常组(Control)、模型组(Model)、溶剂对照组(DMSO)、黄芪甲苷组(AS-IV)、黄芪甲苷组加正常细胞组(AS-IV+N)、黄芪甲苷加自噬抑制剂组(AS-IV+3-MA)、自噬抑制剂组(3-MA)、自噬激活剂组(Rapa)。除正常组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后复氧复糖。镜下观察细胞形态,CCK-8法检测细胞存活率,LDH法检测细胞损伤,免疫荧光染色检测细胞凋亡。结果与正常组比较,模型组细胞胞体突触减少,细胞皱缩,细胞间连接减少;细胞存活率明显降低,LDH漏出率、Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01)。与模型组比较,AS-IV组、Rapa组细胞存活率明显升高,LDH漏出率、Bax/Bcl-2明显降低(P<0.01);3-MA组细胞存活率明显降低,Bax/Bcl-2明显升高(P<0.01);AS-IV+3-MA组无明显差异。结论黄芪甲苷可通过激活自噬,抑制缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡。

黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响

目的观察黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪甲苷组和黄芪甲苷溶剂对照组。其中缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪甲苷组和黄芪甲苷溶剂对照组进行缺氧缺糖3h后再复氧复糖12 h,并于复氧复糖的同时加入黄芪甲苷。用倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果正常对照组PC12细胞贴壁生长,呈多角形,突起明显,突起之间交织成网状,细胞膜光滑且完整,胞体折光性较强。与正常对照组相比,缺氧缺糖/复氧复糖组细胞变圆或肿胀,突起回缩或消失,细胞膜破损,胞体折光性差,细胞活性明显下降(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数明显升高(P<0.05)。与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪甲苷组细胞生长状态见好转,突起较为明显,胞体折光性较好,细胞活性升高(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数下降(P<0.05)。黄芪甲苷溶剂对照组与缺氧缺糖/复氧复糖组相比无明显差异(P>0.05)。结论黄芪甲苷可减轻缺氧缺糖/复氧复糖引起的PC12细胞损伤,提高细胞活性,抑制细胞凋亡。

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2和Bax表达的影响

目的:观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及其mR-NA表达的影响。方法:取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、溶剂对照组(缺氧缺糖/复氧复糖+黄芪注射液溶剂处理组)和黄芪注射液处理组(缺氧缺糖/复氧复糖+黄芪注射液处理组)。除正常对照组外,各组均进行缺糖缺氧0.5 h,再分别于复氧复糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h采用Western blotting法检测海马神经元Bcl-2和Bax蛋白的表达,RT-PCR法检测海马神经元bcl-2和bax mRNA的表达。结果:Western blotting结果显示:与正常对照组比,模型组Bcl-2和Bax蛋白表达明显升高,而Bcl-2/Bax比值下调(P<0.05);与模型组比,黄芪注射液处理组Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达明显降低,Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05),而溶剂对照组Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比值则无显著变化(P>0.05)。bcl-2 mRNA、bax mRNA表达趋势同蛋白。结论:黄芪注射液可提高缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值,抑制Bax表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖引起的海马神经元凋亡。

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响

目的观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因caspase-3表达的影响。方法取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为7组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组(模型组)、黄芪注射液溶剂对照组、黄芪注射液组、DMSO组(二甲基亚砜组,即SP600125溶剂组)、SP600125组、SP600125+黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖。各组于复氧复糖后6、24和72 h采用Western blot方法和RT-PCR方法分别检测caspase-3蛋白和caspase-3 mRNA的表达。结果 Western blot检测显示:各时间点模型组海马神经元caspase-3蛋白平均灰度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),复氧复糖24 h平均灰度值最高;与模型组相比,黄芪注射液溶剂对照组和DMSO组caspase-3蛋白平均灰度值无变化(P>0.05),而黄芪注射液组、SP600125组和SP600125+黄芪注射液组caspase-3蛋白平均灰度值均明显降低(P<0.05);与黄芪注射液组相比,SP600125组和SP600125+黄芪注射液组caspase-3蛋白平均灰度值无变化(P>0.05)。RT-PCR结果显示:各时间点模型组海马神经元caspase-3 mRNA平均光密度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),复氧复糖24h平均光密度值最高;与模型组相比,黄芪注射液溶剂对照组和DMSO组caspase-3 mRNA平均光密度值无变化(P>0.05),而黄芪注射液组、SP600125组和SP600125+黄芪注射液组caspase-3 mRNA平均光密度值明显降低(P<0.05);与黄芪注射液组相比,SP600125+黄芪注射液组和SP600125组caspase-3 mRNA平均光密度值无变化(P>0.05)。结论黄芪注射液可通过抑制JNK3信号通路而减少caspase-3的表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。

Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响

目的:观察Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响。方法:取体外原代培养8 d的海马神经元,随机分为6组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液组、黄芪注射液溶剂(无菌去离子水)对照组、Bcl-2抑制剂组和Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖,各组均于复氧复糖后24 h进行指标检测:采用细胞免疫化学染色法观察细胞形态和caspase-3阳性细胞率,Western blotting法检测海马神经元Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达,RTPCR法检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达。结果:与正常对照组相比,模型组细胞caspase-3阳性率、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表达均明显增强(P<0.05);与模型组相比,黄芪注射液组Bcl-2表达明显增加,细胞caspase-3阳性率、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表达均明显降低(P<0.05);而黄芪注射液溶剂对照组、Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组则无明显差异;黄芪注射液溶剂对照组Bcl-2表达较正常对照组无明显变化,而Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组显著下降(P<0.05)。结论:Bcl-2抑制剂可对抗黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的作用,黄芪注射液通过Bcl-2发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的抑制作用。

沉默beclin1基因对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡的影响

目的探讨beclin1基因对缺氧缺糖/复氧复糖小鼠海马神经元细胞系HT22细胞凋亡的影响。方法取对数生长期的HT22细胞,随机分为4组:正常组(normal)、缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)模型组(model)、beclin1基因沉默组(beclin1^-/-)、转染对照组(control)。除normal组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后进行复氧复糖。利用RNAi技术,针对小鼠c DNA序列设计beclin1干扰序列,用脂质体Lipo2000包裹后转染至HT22细胞。于转染48 h后用荧光显微镜观察转染效率,Western blotting检测细胞beclin1表达情况。各组细胞均于复氧复糖24 h后采用CCK-8法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤情况,免疫荧光染色检测Bax、Bcl-2表达及比值变化,Western blotting检测LC3、P62及Caspase-3表达。SPSS 19. 0统计学软件进行数据分析。结果与normal组相比,model组细胞活力及P62蛋白表达显著降低(P<0. 01),乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Caspase-3表达及Bax/Bcl-2均显著升高(P<0. 01)。与model组相比,beclin1^-/-组细胞活力及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著降低(P<0. 01),LDH漏出率、Bax/Bcl-2及P62、Caspase-3表达显著升高(P<0. 01);control组与model组比较差异无显著性。结论沉默beclin1抑制细胞自噬可使缺氧缺糖/复氧复糖处理的HT22细胞损伤加重,细胞凋亡进一步增加。

黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的自由基机制

目的观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响及其抑制神经元损伤的机制。方法原代培养8 d的大鼠海马神经元随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖。各组于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、48、72 h和120 h测定SOD活力、MDA含量,Western印迹检测caspase-3蛋白的表达,采用原位杂交检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达。结果各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元SOD活性均较正常对照组明显降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05);与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点SOD的活性、MDA含量无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组在各个时间点SOD的活性明显升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05)。原位杂交结果显示:与正常对照组相比,除0 h和0.5 h之外,缺氧缺糖/复氧复糖组各时间点海马caspase-3阳性神经元数目、占神经元总数的百分率及平均光密度值均明显增多(P<0.05),于24 h达到高峰。黄芪注射液溶剂对照组以上指标的变化趋势与缺氧缺糖/复氧复糖组相一致。黄芪注射液组除0 h和0.5 h之外,各时间点以上指标均比缺氧缺糖/复氧复糖组显著减少(P<0.05)。Western印迹检测结果显示:除0 h和0.5 h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3蛋白的平均灰度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),24 h最高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3蛋白的平均灰度值无明显变化(P>0.05),而黄芪注射液组除0 h和0.5 h外,在各个时间点caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05)。结论黄芪注射液可通过减少自由基生成,抑制caspase-3的表达,进而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的作用

目的观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因caspase-3表达的影响。方法取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h,再复氧复糖。各组于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、48、72 h和120 h采用免疫组织化学染色法和Western blot检测caspase-3蛋白的表达,采用原位杂交检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达。结果免疫组化结果显示:与正常对照组相比,除0 h和0.5h之外,缺氧缺糖/复氧复糖组各时间点海马caspase-3阳性神经元数目占神经元总数的百分率均明显增多(P<0.05),于24 h达到高峰。黄芪注射液溶剂对照组以上指标的变化趋势与缺氧缺糖/复氧复糖组相一致。黄芪注射液组除0 h和0.5 h之外,各时间点以上指标均比缺氧缺糖/复氧复糖组减少(P<0.05)。Western blot检测结果显示:除0 h和0.5 h外,各时间点缺氧缺糖/复氧复糖组海马神经元caspase-3蛋白的平均灰度值均较正常对照组明显增加(P<0.05),24 h最高;与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,黄芪注射液溶剂对照组各时间点caspase-3蛋白的平均灰度值无变化(P>0.05),而黄芪注射液组除0 h和0.5 h外,在各个时间点caspase-3蛋白的平均灰度值明显降低(P<0.05)。原位杂交检测结果显示:caspase-3 mRNA阳性神经元形态、数目占神经元总数的百分率的变化趋势与caspase-3蛋白的变化趋势完全一致。结论黄芪注射液可抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关基因caspase-3的表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元的凋亡。

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2、bax及cyt-c蛋白形态学表达的影响

目的观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2、bax及cyt-c蛋白表达的影响,探讨黄芪注射液防治海马神经元凋亡的作用机制。方法取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液溶剂对照组和黄芪注射液组。除正常对照组外,各组均进行缺糖缺氧0.5h,再分别于复氧复糖后0、0.5、2、6、24、72和120h采用细胞免疫化学法检测海马神经元bcl-2、bax、cyt-c蛋白的表达。结果与正常对照组比,模型组bcl-2、bax、cyt-c蛋白表达明显升高,而bcl-2/bax比值下调(P<0.05)。与模型组相比,黄芪注射液组bcl-2蛋白表达及bcl-2/bax比值升高,cyt-c、bax蛋白表达明显降低(P<0.05);而黄芪注射液溶剂对照组bcl-2、bax、cyt-c蛋白表达及bcl-2/bax比值则无显著变化(P>0.05)。结论黄芪注射液可提高缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元bcl-2蛋白表达及bcl-2/bax比值,抑制bax、cyt-c蛋白表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖引起的海马神经元凋亡。

缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞自噬的形态学变化与细胞凋亡的关系

目的:观察缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞自噬的形态学变化及其与细胞凋亡的关系,探讨自噬对PC12细胞的保护作用。方法:取对数生长期的PC12细胞,随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、自噬抑制剂组和自噬激活剂组。其中缺氧缺糖/复氧复糖组、自噬抑制剂组和自噬激活剂组进行缺氧缺糖3 h后再复氧复糖12 h,自噬抑制剂组和自噬激活剂组于复氧复糖的同时分别给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和自噬激活剂雷帕霉素。用透射电子显微镜和单丹磺酰尸胺荧光染色检测自噬小体的变化,Annexin V-FITC/PI流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡的情况。结果:与正常对照组相比,缺氧缺糖/复氧复糖组的自噬小体增多(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数升高(P<0.05)。与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,自噬抑制剂组的自噬小体明显减少(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡指数显著升高(P<0.05),而自噬激活剂组自噬小体变大,数量明显增多(P<0.05),并偶见自噬溶酶体,细胞凋亡率和凋亡指数显著下降(P<0.05)。结论:缺氧缺糖/复氧复糖可以诱导PC12细胞发生自噬,且细胞自噬可以抑制细胞凋亡,发挥神经保护作用。