缺血缺氧脑瘫大鼠的时效研究

目的:基于缺血缺氧脑瘫大鼠神经功能评分(Zea-Longa评分)、脑组织肉眼观和大脑海马区胱天蛋白酶-9(Caspase-9)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)的表达水平变化,探讨缺血缺氧模型脑瘫大鼠的有效时长。方法:选取3周龄斯泼累格·多雷(SD)健康大鼠,随机分为正常组和模型组,采用改良的Rice-Vannucci方法建立脑瘫模型,造模后第1、7、14、21天,观察各组大鼠的一般情况并进行神经功能评分,在第7、14、21天分批处死大鼠并取脑组织,观察各组大鼠左侧脑组织,检测海马区Caspase-9、Caspase-3的表达水平。结果:一般情况:造模后第1天,与正常组比较,模型组大鼠左侧瞳孔缩小、姿势异常、自发或夹尾左旋、自主活动减少、兴奋性降低、肌肉颤动、头颤,抽搐,抓取时抵抗反应明显,随着时间延长,以上异常行为逐渐消失,造模后21 d基本消失不见,但左侧瞳孔一直小于对侧;Zea-Longa评分:与正常组比较,模型组造模后7、14 d Zea-Longa评分较高,差异有统计学意义(P<0.05);脑组织肉眼观:与正常组比较,模型组造模后7、14及21 d大鼠左侧脑组织有不同程度的萎缩和坏死;免疫组化结果:与正常组比较,模型组造模后7 d、14 d Caspase-9、Caspase-3的表达水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:3周龄缺血缺氧脑瘫模型大鼠的有效时长为14~21 d,可干预14 d。

子宫主动脉结扎大鼠缺氧缺血脑病模型的声辐射力脉冲弹性成像结果与神经细胞凋亡率的相关性研究

目的:探讨子宫主动脉结扎大鼠缺氧缺血脑病模型的声辐射力脉冲弹性成像(acoustic radiation force impulse elastography,ARFI elastography)结果与神经细胞凋亡率的相关性。方法:选用30只孕晚期Wistar大鼠,通过子宫主动脉结扎的方法构建大鼠缺氧缺血性脑病(hypoxie-ischemic encephalopathy,HIE)模型。根据结扎时间分为结扎10分钟组、结扎20分钟组和对照组。每组模型在不同时间点利用彩色多普勒测定脑血流参数(Vs、Vd、RI),利用声辐射力脉冲弹性成像测定声触诊量化(VTQ)值。将HIE模型鼠部分大脑制作病理切片后进行HE染色和TUNEL细胞凋亡检测。最后通过统计分析计算超声结果和神经细胞凋亡率的相关性。结果:子宫动脉结扎10分钟组和20分钟组的脑血流参数Vs和RI值均低于对照组(P<0.05),而Vd值差异不显著(P>0.05)。两个HIE模型组的VTQ值高于对照组,且两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。所有数值在各检测时间点之间没有明显变化。HE染色结果显示,HIE模型组脑部神经细胞发生明显变形。TUNEL实验显示模型组中脑神经细胞数目少于对照组,细胞凋亡率高于对照组。最后,通过计算得到,声辐射力脉冲弹性成像测量的VTQ值与脑神经细胞凋亡率呈显著高度相关性。结论:子宫主动脉结扎大鼠缺氧缺血脑病模型的声辐射力脉冲弹性成像结果与神经细胞凋亡率之间存在显著相关性。

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型的制作

目的 :建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)模型 ,并讨论模型制作中的有关问题。方法 :健康 7日龄SD新生大鼠随机分为空白对照组 (n =18) ,假手术组 (n =8)和HIBD模型组 (n =19) ,采用经典Rice法制作新生大鼠HIBD模型 ,于 14日龄处死 ,观察HIBD后大鼠体重增长情况 ,左、右脑重比值变化 ,行为能力表现 ,以及脑组织病理形态学改变。结果 :①HIBD模型组体重增长明显慢于空白对照组和假手术组 (P <0 .0 1)。②HIBD组制成模型后全部发生行为异常改变 ,6 3 .16 %翻身不能 ,89.47%自发或夹尾左旋 ,抽搐占 47.37%。空白对照组和假手术组未见行为异常表现。③HIBD模型组左 /右脑重比值明显低于空白对照组和假手术组 (P <0 .0 1)。④肉眼观察HIBD组左脑萎缩者占 84.2 1%,出现软化灶占 31.5 8%,液化灶 5 2 .6 3 %,形成空洞脑者占 15 .79%;HE染色可见左侧大脑半球神经元损伤及神经胶质细胞增生 ;空白对照组和假手术组左、右脑无明显异常。结论 :本方法制作新生大鼠HIBD模型成功 ,该模型价格相对低廉、成功率高、重复性好、易于制作 ,值得进一步推广。模型制作中环境温度应保持在 36～ 37℃。

缺血缺氧性脑性瘫痪鼠脑白质和脑皮层炎症细胞因子基因表达谱的特征

目的探讨脑性瘫痪(cerebral palsy,CP)发生的炎症细胞因子网络调控机制。方法 30只出生7日龄清洁级健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为2组:CP模型组和对照组,每组15只。应用一侧颈总动脉结扎结合缺氧的方法构建CP大鼠模型,即幼鼠结扎右颈总动脉结合体积分数为0.08的O2与体积分数为0.92的N2缺氧环境的方法制作幼鼠CP模型。对照组仅切开幼鼠颈部皮肤后缝合皮肤伤口,未置于缺氧环境。幼鼠CP模型构建术后3w,采用足印步态重复间距试验、平衡木试验检测鼠的运动功能,进行行为学评价;取鼠脑组织行苏木精-伊红染色观察脑组织病理变化,以行为学评价和病理检测结果鉴定CP模型是否构建成功。分别取成功构建的CP模型组和对照组大鼠脑白质和脑皮层组织,应用炎症细胞因子与受体基因芯片进行基因表达检测,绘制基因表达谱,筛选有表达差异的基因。结果应用一侧颈总动脉结扎结合缺氧的方法成功建立了大鼠CP模型;与对照组相比,CP模型组脑白质和脑皮层组织中表达上调的促炎性反应细胞因子与受体基因分别有10个和8个(P<0.05),表达下调的抗炎细胞因子与受体基因分别有3个和2个(P<0.05)。结论 CP大鼠脑白质和脑皮层存在促炎症细胞因子基因表达上调,抗炎症细胞因子基因表达下调,从而导致促-抗炎性细胞因子网络和促-抗炎性反应体系平衡失调,这可能是CP发生中出现高促炎性反应状态的原因和新机制。

化瘀生脉方对内皮细胞缺血缺氧保护作用的实验研究

为研究化瘀生脉方对体外培养的内皮细胞缺血缺氧损伤模型的保护作用。将化瘀生脉中药兔血清培养液、正常兔血清培养液分别加入缺血缺氧损伤的内皮细胞培养,分别称为化瘀生脉组、空白对照组。另外,将正常兔血清培养液加入正常内皮细胞培养,称为正常组。进行细胞死亡率的检测,细胞培养液中乳酸脱氢酶的测定,并于透射电镜下观察内皮细胞的形态结构变化。结果显示,3组细胞死亡率、LDH漏出量方差分析均为P<0.001;正常组内皮细胞死亡率、LDH漏出量最小,空白对照组最高,化瘀生脉组低于空白对照组。3组均数两两比较,P<0.01,差异均有显著性。透射电镜下见,化瘀生脉组较空白对照组粗面内质网数目较多,无扩张,其上附着的核糖体存在,平滑内质网扩张程度减弱。表明化瘀生脉方对内皮细胞有一定的保护作用。

不同疗程胞二磷胆碱对新生大鼠脑皮质缺氧缺血性损伤的保护作用

目的通过观察不同疗程胞二磷胆碱对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的疗效,确定最佳疗程。方法按照 Rice 方法制备新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型,腹腔注射胞二磷胆碱500mg/kg·d,疗程分别为10天、20天、30天,对照组注射等量生理盐水。另设一组延迟10始开始治疗。30天后同时处死,取脑,HE 染色及 TUNEL 染色后光镜观察。结果胞二磷胆碱即时治疗组大鼠较生理盐水组,其 HE 染色可见脑皮质细胞排列较整齐规则,无明显坏死灶,无明显凋亡细胞改变。TUNEL 染色其脑皮质凋亡细胞率明显降低,有显著性差异(P<0.05)。治疗10天与治疗20天、30天组间差异明显(P<0.01,P<0.01),而治疗20天与30天两组间凋亡细胞阳性率无统计学差异(P>0.05)。延迟治疗组与生理盐水组比较无明显差异(P>0.05)。结论胞二磷胆碱治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤有效,一定时间(20天)内随疗程延长疗效增强,但过度延长疗程无意义。同时强调治疗有一定时间窗,应尽可能早的开始治疗。

大鼠皮层神经细胞糖氧剥离体外模型的建立及细胞形态学观察

目的本研究利用培养大鼠皮层神经细胞,观察化学缺氧剂及无糖培养基对神经细胞的急性损伤作用,以建立一简单有效且稳定的神经细胞缺血缺氧模型。方法SD大鼠胎鼠大脑皮层神经元培养,连二亚硫酸钠消除培养基中的氧合并培养基缺糖建立神经细胞缺血缺氧模型,光镜下观察。结果在大剂量耗氧剂以及无糖培养基协同作用下,在较短的时间内就可造成神经细胞的损伤。结论连二亚硫酸钠加无糖培养基制造体外神经细胞损伤是一种行之有效的糖氧剥离模型。

培养人脐静脉内皮细胞慢性缺血缺氧模型

目的 建立改良的体外培养人脐静脉内皮细胞缺血缺氧的模型。方法 取培养人脐静脉内皮细胞 ,用无菌石蜡油覆盖于低糖细胞培养液表面 ,使培养细胞处于缺血缺氧状态。检测缺血缺氧细胞的形态、培养液中乳酸脱氢酶漏出量及Ⅷ因子相关抗原表达及细胞死亡率。结果 与对照组相比 ,随着缺血缺氧时间的增加 ,内皮细胞形态发生明显改变 ,细胞浆内出现空泡样变性 ,细胞死亡率增加 ,Ⅷ因子相关抗原表达及细胞乳酸脱氢酶漏出量均显著增加 (P <0 .0 1 )。结论 该模型可使细胞受到渐进性损伤 ,损伤结果与体内细胞缺血缺氧后所致的病理学变化相似 ,证实该模型具有一定的可靠性、操作简便、可重复性强。

新生猪缺氧缺血性脑损伤模型中脑氧饱和度－时间阈值的研究

背景危重新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxia．ischemia，H．I）的检测和脑损伤预防是目前的难题。近红外光谱分析（near—infraredspecVoscopy，NIRS）作为一种无创的床边监测技术可以解决上述问题，但是，对于脑损伤中NIRS脑氧饱和度（O，saturation，ScO2）的存活力-时间阈值，目前尚不明确。本研究目的是探讨ScO2为35％时的H—I持续时间（引起神经生理障碍的存活力闽值）与神经系统预后的关系。方法46头新生猪，经芬太尼．咪达唑仑麻醉后，放置NIRS及脑功能监测（cerebralfunc．tionmonitor，CFM）探头，记录ScO2及脑皮质电活动（eleclrocorticalactivity，ECA）。夹闭颈总动脉后，调节吸入氧浓度复制出H—I模型（ScO2为35％同时伴有ECA降低）。分别于H-I1小时、2小时、3小时、4小时、6小时及8小时后，通过神经行为学及组织病理学评价存活个体的神经系统预后情况。结果H—I持续1小时或2小时，ECA及ScO2在再灌注期很快恢复正常，受试个体的神经功能也恢复至正常水平。H-I持续时间超过2-3小时，再灌注期ECA显著下降，ScO2则明显增加，提示体内存在组织氧代谢持续受抑制。H—I持续时间超过2小时，神经损伤的发生率呈线性增加，约为每小时增加15％。结论ScO2达35％时，H-I损伤的生存一时间阈值为2—3小时，标志为再灌注期NIRS及CFM出现异常。本研究结果提示，联合应用NIRS和CFM有助于预测神经系统的预后，H—I损伤期间存在几个小时的时间窗，可以有效的预防神经功能损伤。

四逆汤及拆方对缺血缺氧大鼠心肌细胞H9C2保护作用的探讨

目的:研究四逆汤及拆方水煎液对体外培养的缺血缺氧大鼠心肌细胞H9C2的保护作用。方法:利用厌氧培养盒构建厌氧环境,以D-Hanks液模拟缺血液,构建H9C2的缺血缺氧模型;将加有D-Hanks稀释过的四逆汤及拆方水煎液的H9C2置于厌氧盒中培养,MTT法测定H9C2的存活率;ELISA法测定细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量。结果:四逆汤及拆方加药组(四逆汤加药组、附子+干姜加药组、附子+甘草加药组、甘草+干姜加药组、甘草加药组、附子加药组、干姜加药组)在浓度均为5mg生药/ml时,与模型组比较均能提高H9C2的存活率;其中附子+干姜组(108.2±5.0)、四逆汤全方组(82.3±2.0)、附子组(78.4±10.0)均能明显提高缺血缺氧H9C2的存活率;细胞上清中CK-MB含量与TNF-α含量呈正相关(r=0.866),细胞存活率与TNF-α含量呈负相关(r=-0.0846)。结论:四逆汤及拆方水煎液通过抑制细胞TNF-α的释放,显著减少H9C2的凋亡,提高细胞存活率,对缺血缺氧的H9C2有直接保护作用。

新生鼠缺氧缺血性脑损伤后经脑室人神经干细胞移植的实验研究

目的研究新生鼠缺氧缺血性脑损伤后经脑室移植人胚胎脑神经干细胞后,植入细胞的存活、迁移及分化情况。方法孕12周人胚胎神经干细胞在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和白血病细胞抑制因子的N2培养基(D/F12+N2+B27)中培养11天。生后7天的新生SD大鼠32只建立缺氧缺血性脑病模型,3天后将培养的人神经干细胞制成悬液(1.0×105/μl),采用立体定向移植至实验动物损伤侧脑室。移植后1、2、4周及3个月(每时间点各8只)取脑组织行HE染色和免疫组织化学分析。结果移植后1周大量抗人细胞核蛋白抗体阳性的植入细胞从脑室沿胼胝体向外迁移并到达损伤区,以损伤侧皮层、海马多见,在不同区域可见与宿主细胞类似的分化的植入细胞:移行至皮层的植入细胞85%分化为抗人细胞核蛋白神经丝蛋白或抗人核蛋白神经元管蛋白抗体双阳性的皮层细胞,而位于移行区域的植入细胞60%表达为抗人核蛋白胶质纤维酸性蛋白抗体双阳性的星形胶质细胞,其余细胞仍在迁移中未分化。移植后2周更多的移植细胞到达损伤区,移植后4周及3个月植入细胞数较前明显减少。结论人胚胎神经干细胞经脑室移植至缺氧缺血性脑损伤的鼠脑后能存活、迁移,并依迁移区域的不同分化为神经元和星形胶质细胞。

新生鼠脑损伤后松果体细胞的一氧化氮合酶与细胞凋亡关系的初步研究

为了探讨新生鼠发生缺氧缺血性脑损伤时松果体细胞的诱生型一氧化氮合酶 ( i NOS)表达与松果体细胞凋亡及形态学改变的关系 ,用 7日龄新生 Wistar大鼠 ,结扎左侧颈总动脉 ,术后 2 h吸入 8%浓度氧 2 h,建立新生儿缺氧缺血性脑病模型( HIBD)。分别于建模后 0 h、2 4h、48h处死动物 ,剥取松果体 ,观察松果体细胞的 i NOS表达及细胞凋亡 ,电镜观察松果体形态学改变。结果表明 :( 1)新生鼠脑损伤后松果体的 i NOS在 0 h、2 4h含量与对照组相比明显升高 ;( 2 )脑损伤后松果体凋亡细胞早期明显增多 ,尤以 0 h、2 4h为主 ;( 3)电镜观察 :脑损伤后松果体的形态学也以 0 h、2 4h改变为明显 ,出现线粒体明显肿胀、粗面内质网极度扩张、细胞变性。提示 :( 1)新生鼠缺氧缺血性脑损伤后 0 h、2 4h松果体细胞的 i NOS表达增加 ,以后逐渐下降 ,48h表达减少。 ( 2 ) TUNEL法原位检测细胞凋亡与 i NOS表达同步改变 ,i NOS表达对细胞凋亡有促进作用。 ( 3) i

沙棘总黄酮对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是新生儿常见疾病，致死、致残率较高。现代药理学研究表明沙棘总黄酮具有阻滞钙离子内流、清除自由基、抗生物膜过氧化等作用。因此，本研究以新生大鼠缺氧缺血性脑病模型，观察沙棘总黄酮对神经细胞的保护作用。