复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达

在人泡沫逆转录病毒 (humanfoamyvirus ,HFV)原病毒全长克隆pHRSV13的基础上 ,缺失病毒基因组的env基因和bel基因 ,构建了一个表达标记基因neo和报道基因 gfp的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI GFP。在与辅助质粒 p△GP共转染情况下 ,得到复制缺陷型的重组病毒颗粒GPSNI GFP。该病毒颗粒可以感染多种宿主细胞 。

携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的 :构建携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,采用平末端连接法获得含人TGFβ1cDNA3’ -端活性肽编码基因正、反向插入的重组病毒质粒 ,脂质体介导转染包装细胞PA317,获得含TGFβ1正、反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ-AS ,感染NIH3T3细胞 ,测定病毒滴度。分别转染膀胱癌EJ细胞 ,通过Southern -blot和半定量RT -PCR方法评价载体整合及表达效率。结果 :pRevTβ、pRevTβ-AS载体病毒滴度分别为0.84、0.88×105CFU/ml,EJ细胞外源基因的整合率为100 %,正、反义基因转染细胞内TGFβ1mRNA的相对转录水平为1.89和0.35。结论 :构建的携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体符合细胞体外转染要求 ,能与肿瘤细胞高效整合 ,有效表达。

猴D型逆转录病毒的研究进展

猴D型逆转录病毒（simiantype-Dretrovirus，SRV），是猴获得性免疫缺陷综合征（Simian acquired immunodeficiency syndrome，SAIDS）即猴艾滋病的主要病原体之一。

高效抗逆转录病毒治疗对艾滋病患者肌酸激酶同工酶MB型的影响

目的探讨获得性免疫缺陷综合征（AIDS）未接受高效抗逆转录病毒治疗（HAART）患者与经HAART患者肌酸激酶同工酶MB型（CK-MB）的异常检测率,以了解未行HAART AIDS患者与治疗患者心肌损害的差异,为临床AIDS患者的诊治提供依据。方法收集贵阳市第五人民医院2013年3～9月117例AIDS住院患者资料,按是否行HAART,分为对照组（未HAART）76例和HAART组41例,采用蛋白质印迹法测定两组CK-MB水平,比较两组患者CK-MB异常检测率的差异情况。结果 117例AIDS患者中,CK-MB异常23例,异常检测率19.66%。对照组76例中CK-MB异常12例,异常检测率15.79%;HAART组41例中CK-MB异常11例,异常检测率26.83%。两组异常检测率比较,差异有统计学意义（χ^2=55.52,P〈0.05）。结论 HAART与AIDS患者心肌损害相关。

逆转录病毒载体介导的转基因鸡研究进展

转基因鸡作为重要的经济动物和理想的生物反应器,具有广阔的应用前景。鸡基因组测序的完成加快了转基因鸡的研究和发展。病毒载体法是转基因鸡制备的主导方法之一,具有效率高和遗传稳定性良好的优势。本文对逆转录病毒载体特征、复制缺陷型病毒载体和复制整合双缺陷型病毒载体的优缺点及其介导的转基因鸡研究进行综述,展望人工核酸酶技术结合复制整合双缺陷型逆转录病毒载体在转基因鸡研究领域的应用前景。

复制缺陷型人泡沫病毒载体辅助质粒pΔGP的构建及转染小肠癌细胞的研究

在人泡沫病毒原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失突变gag和pol基因,并且用SV40polyA加尾信号替代人泡沫病毒的3′LTR,构建辅助质粒pΔGP.将复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP和辅助质粒pΔGP分别转染和共转染小肠癌HIC细胞系,荧光显微镜检测发现共转染pGPSNI EGFP和pΔGP的HIC细胞能够强烈表达绿色荧光蛋白,转染有复制缺陷型人泡沫病毒载体质粒pGPSNI EGFP的HIC细胞能够表达少量的绿色荧光蛋白,而转染有辅助载体pΔGP的HIC细胞不表达绿色荧光.结果证明复制缺陷型人泡沫病毒载体的构建成功,表明人泡沫病毒env基因3′端的内部启动子IP具有弱启动子的活性,并且bel基因产生的调控蛋白能够反式激活人泡沫病毒内部启动子IP和5′LTR的启动子.

针对人类免疫缺陷病毒结构蛋白Gag-Pol的抑制剂及其作用机制研究进展

Gag-Pol蛋白是人类免疫缺陷病毒(HIV)重要结构蛋白之一,其组成成分包含了HIV的基本骨架蛋白和生命周期中所需要的功能酶,目前以Gag-Pol上不同的功能区为靶点开发的抑制剂包括衣壳(CA)抑制剂、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和整合酶抑制剂等。CA抑制剂通过抑制CA的成熟或者破坏CA的组装进而影响HIV复制。蛋白酶抑制剂主要的作用机制是抑制蛋白酶对切割位点CA-间隔多肽1(SP1)的切割,逆转录酶抑制剂通过模仿逆转录底物,阻断HIV的逆转录过程,整合酶抑制剂通过靶向整合酶活性中心—锌指结构影响整合酶活性。本文总结了针对HIV Gag-Pol蛋白的抑制剂及其作用机制,并对已批准上市成药的用法用量进行综述,为今后临床联合用药和针对HIV Gag-pol蛋白的新型抑制剂开发提供参考。

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型载体研究进展

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 (humanimmunodeficiencyvirustypeⅠ ,HIV Ⅰ )为慢病毒家族成员之一 ,除 gag ,pol与env等结构基因外 ,其结构中还含有编码 2个调节蛋白及 4个附属蛋白的基因。目前已构建了多种类型的复制缺陷性HIV Ⅰ载体 ,产生的病毒滴度最高可达 10 7TU /ml;对包装细胞系的研究发现 ,将 4个附属基因全部去除对载体的转导能力并无显著影响。基因组分离式包装系统降低了产生具有复制能力的病毒的可能性。HIV Ⅰ载体具有两大特点 :可有效转导人CD34+造血干 /祖细胞、重复注射不引起排斥反应。改建后的HIV Ⅰ载体具有广泛的宿主范围。

广州抗逆转录病毒治疗后低水平HIV-1病毒载量感染者基因型耐药特征分析

目的分析广州市抗逆转录病毒治疗(antiretroviral therapy,ART)后HIV-1病毒载量介于50~200 copies/mL的感染者基因型耐药发生特征。方法募集2023年1月至7月广州医科大学附属市八医院感染门诊接受ART满6个月,且HIV-1病毒载量介于50~200 copies/mL的感染者。用0.5 mL血浆于4℃超速离心浓缩病毒后提取RNA,经逆转录和巢式PCR扩增HIV-1 pol基因片段。获得基因序列经COMET HIV-1进行分型,并用Mega 11构建系统邻接法进化树验证亚型。经斯坦福HIV耐药数据库解析耐药发生情况。结果共随访11799例感染者,发现415例(3.5%)低水平病毒载量感染者。从完成检测的297例感染者中扩增获得154条pol基因片段序列(52.0%)。主要基因亚型为CRF01-AE(34.4%,53/154)和CRF07-BC(31.2%,48/154)。耐药相关突变(drug resistance mutations,DRMs)发生率为37.0%(57/154),最常见的DRMs为非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)突变V179E(11.7%,18/154)和核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)突变S68G(6.5%,10/154)和M184V(5.2%,8/154)。对任一药物耐药发生率为17.5%(27/154),其中NVP耐药率为11.7%(18/154),EFV耐药率为11.0%(17/154),RPV耐药率为10.4%(16/154)。结论广州ART后低水平病毒载量感染者耐药相关突变发生率较高(18.2%~37.0%),对我国常用的一线抗病毒药物存在不同程度耐药。应加强治疗后低病毒载量感染者的耐药监测,以优化治疗方案、改善临床结果。

适配子对人类免疫缺陷病毒的抑制作用

人类免疫缺陷病毒在机体细胞内不断复制并发生变异,以拮抗外界环境发生的变化。尽管高效抗逆转录病毒治疗方案(HAART)在治疗艾滋病方面取得了较大进展,但该疗法服用方法复杂、副作用较大及药物价格昂贵,因此仍需要开发新的方法来治疗HIV-1感染。最近备受关注的是适配子为基础的疗法。适配子具有特异性高、靶标单一和通用性等特点,可将其用于治疗多种疾病。在本文中,我们将介绍核酸适配子抗HIV-1作用的研究进展,并讨论抗HIV-1核酸适配子的应用前景及面临的挑战,为开发新的抗HIV-1药物提供理论支持。

河南省2018年至2022年抗反转录病毒治疗失败的人类免疫缺陷病毒感染/艾滋病患者基因型耐药的影响因素

目的分析河南省抗反转录病毒治疗(ART)失败的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染/艾滋病(AIDS)患者基因型耐药的情况及其影响因素,为调整ART方案、减少耐药提供依据。方法纳入2018年1月至2022年12月河南省接受ART 24周以上并出现病毒学失败(HIV RNA≥500拷贝/mL)的HIV感染/AIDS患者,收集基线CD4+T淋巴细胞计数、ART方案等临床资料,并于郑州市第六人民医院进行HIV-1基因亚型及其耐药序列突变检测,将序列提交美国斯坦福大学HIV耐药解释系统比对检测结果,确定对核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂(INSTI)的基因型耐药结果。采用多因素logistic回归分析ART失败患者发生耐药的影响因素。结果982例HIV感染/AIDS患者中899例成功扩增获得序列,检出耐药737例,耐药率为81.98%(737/899),其中对NRTI、NNRTI、PI、INSTI的耐药率分别为71.97%(647/899)、79.31%(713/899)、5.23%(47/899)和2.72%(20/734)。737例耐药患者中发生2类药物同时耐药者最多,占79.78%(588/737),主要为NRTI+NNRTI耐药[79.10%(583/737)];99例(13.43%)仅发生1类药物耐药,48例(6.51%)发生3类药物同时耐药,2例(0.27%)对上述4类药物均耐药。共检测到10种HIV-1基因亚型,其中B亚型最多,占59.73%(537/899),其次为流行重组型(CRF)01AE亚型[21.91%(197/899)]和CRF07BC亚型[9.45%(85/899)]。基线CD4+T淋巴细胞计数、ART方案和HIV-1基因亚型是耐药发生的独立危险因素,基线CD4+T淋巴细胞计数<100/μL的患者发生耐药的风险是CD4+T淋巴细胞计数≥250/μL的4.55倍[95%可信区间(CI)2.69~7.70];使用2NRTIs+NNRTI方案的患者发生耐药的风险是使用2NRTIs+INSTI方案的4.51倍(95%CI 1.75~11.63);感染B亚型和CRF01AE亚型的患者发生耐药的风险分别是感染CRF07BC亚型的2.18倍(95%CI 1.10~4.29)和2.70倍(95%CI 1.26~5.78)。结论河南省ART失败的HIV感染/AIDS患者基因型耐药发生率较高,基线低CD4+T淋巴细胞水平、2NRTIs+NNRTI治疗方案、B亚型和CRF01AE亚型是患者发生耐药的危险因素。

上海地区猴免疫缺陷病毒和猴D型逆转录病毒感染的血清学调查

为了解上海地区实验用猴感染猴免疫缺陷病毒（SIV）和猴D型逆转录病毒（SRV）的情况,用间接ELISA方法对2012—2015年上海各实验用猴生产单位送检的475份猴血清进行了检测。结果显示SIV抗体阳性血清20份,阳性率4.21%;SRV抗体阳性血清1份,阳性率0.21%,阳性率与送检年份和无相关性。本研究为上海地区实验用猴SIV和SRV的预防提供参考依据。

猿泡沫病毒感染在灵长目动物管理者中的传染

几种猿的逆转录病毒能够感染人类,1994年报道,一名实验工人在1993年一次实验中感染了猿的免疫缺陷病毒。1995年,疾病控制和预防中心首次运用连续监视系统以及随后的自愿实验和辅导项目。

HAART过程HIV/AIDS患者PBMC中HIV-1前病毒DNA的动态变化及其意义

目的分析高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)过程中HIV-1感染者/艾滋病(HIV/AIDS)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中HIV-1前病毒DNA的动态变化及其在临床治疗中的意义。方法 38例接受HAART最长至168周的HIV/AIDS患者纳入本研究,在不同随访时间点检测患者PBMC中HIV-1 DNA水平,并与同时间点外周血CD4^+T细胞数量及血浆HIV-1 RNA病毒载量进行比较,数据进行统计学处理及相关性分析。结果随着HAART时间的增加,患者PBMC中HIV-1前病毒总DNA及血浆HIV-1 RNA水平逐渐下降(r=-0.27,P=0.000 3;r=-0.39,P <0.000 1),外周血CD4^+T细胞计数逐渐上升(r=0.55,P<0.000 1);HIV-1前病毒总DNA水平与CD4^+T细胞数量之间呈负相关(r=-0.16,P=0.039 7),与HIV-1 RNA病毒载量之间呈正相关(r=0.35,P <0.000 1)。不同HAART方案之间HIV-1前病毒总DNA水平随HAART进行而下降的患者比例没有差异(x^2=1.030,P=0.598)。结论 HAART过程HIV/AIDS患者PBMC中HIV-1前病毒DNA水平逐渐下降,与外周血CD4^+T细胞数量、血浆HIV-1 RNA病毒载量之间有一定相关性,可作为HAART效果监测及病情预测的一个指标。

应用高通量测序方法研究CRF01-AE亚型HIV-1毒株耐药突变的分子进化规律

目的探讨CRF01-AE亚型人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)毒株在药物选择压力下耐药突变发生和演变的规律。方法选取5例一线方案治疗失败的CRF01-AE亚型HIV-1患者,收集其6~8年抗病毒治疗过程中的系列血样,应用高通量测序方法进行基因型耐药突变分析。结果①5例患者在启动治疗后早期即出现M184V突变以及非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)类耐药突变,常见的有K101E、G190A和K103N,其中M184V+G190A+TAMs是常见突变组合,停药或更换二线药物,这些突变也始终存在。②胸腺嘧啶脱氧核苷类似物变异(TAMs)突变形成过程中,有3例患者表现为TAM2路径,1例患者为TAM1途径,还有1例患者前期只有TAM2路径的突变,后期累加上TAM1途径的突变。③有3例患者在治疗过程中分别形成TAMs、Q151M复合体和T69插入复合物等多重耐药突变,更换二线方案后仍然治疗失败。结论①CRF01-AE亚型耐药患者在用药早期即开始出现耐药突变,数种突变逐渐累加,最终导致临床耐药,应尽早进行耐药突变监测。②TAMs突变通过2种途径竞争性发展,CRF01-AE亚型更偏向于TAM2途径,但随着治疗时间延长,2种途径可以产生融合。③更换二线方案前应排查针对替诺福韦(TDF)的耐药突变,其可能会导致二线方案无效。

HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂药效团模型构建及新抑制剂的搜索

【目的】构建I型人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)非核苷类逆转录酶抑制剂(nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)的药效团模型,通过对中药化学数据库(traditional Chinese medicine database,TCMD)的搜索,在中药中寻找新型抗耐药的NNRTIs。【方法】从已知的NNRTIs与逆转录酶复合物的晶体结构出发,通过构象分析和药效团识别等方法,构建NNRTIs的药效团模型并检验其可靠性;基于药效团模型对TCMD进行数据库搜索,发现新型潜在的NNRTIs。【结果】从PDB中检索出2010年至2014年RT与NNRTIs复合物的晶体结构30个,从中抽提出其活性配体,建立了一个包含30个活性配体的小分子数据库;通过对上市药物TMC278和TMC125及高活性抑制剂DJZ的构象叠合和药效特征基团分析构建了新的NNRTIs药效团模型,该模型包含了5个药效特征基团;以符合这5个药效特征基团中任意4个为条件,在活性配体小分子数据库中验证性搜索出18个化合物,检出率为60.0%;基于五点药效团模型对TCMD进行数据库搜索得到272个化合物。【结论】以TMC278、TMC125和DJZ构建的五点药效团模型,以符合其中任意4个为条件,在活性配体小分子数据库中的检出率达到60.0%,表明所建药效团模型是可靠的。

逆转录聚合酶链反应在艾滋病患者HIV-1毒株env基因的序列测定和亚型分析中的应用

目的了解深圳地区艾滋病患者中Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)毒株各亚型的感染情况,及其不同亚型对患者疾病进程的影响。方法采用巢式逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法对26例艾滋病患者血浆中的HIV-1毒株的env基因片段进行扩增,并对扩增片段进行序列测定和分析,同时检测其CD4+细胞计数与血浆病毒载量。结果基因系统树显示深圳地区26例艾滋病患者的HIV-1毒株env基因序列,B亚型12例,其中1例与欧美B亚型序列十分接近,11例与中国云南B亚型序列十分接近;循环重组亚型AE(CRF01AE)13例,均与泰国AE亚型序列十分接近。比较B、AE亚型感染患者的CD4细胞计数与病毒载量之间的差异无统计学意义。结论深圳地区艾滋病患者中以HIV-1毒株以B亚型和循环重组亚型AE最常见,尚未观察到B、AE亚型对艾滋病进展的影响。

两种HIV非核苷类逆转录酶抑制剂耐药病毒株的体外选择和鉴定

两种HIV非核苷类逆转录酶抑制剂(nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)JB25和JB26在体外均具有显著的抗HIV活性,为了在临床试验前阐明病毒是否容易对这两种药物产生耐药性及导致耐药性的病毒基因突变,在体外诱导并鉴定了对这两种化合物耐药的HIV-1毒株。以HIV-1NL4.3作为亲代野生型病毒感染MT-2细胞,从两种化合物2倍的IC50开始,以细胞病变(cytopathic effect,CPE)为指标,将病毒在含有浓度逐渐增加的药物的条件下连续传代,每代均在超过75%的MT-2细胞出现CPE后收集病毒培养上清液,然后取1mL接种新的MT-2细胞同时提高药物浓度为原来的2倍,共计传12代。JB25在第6代出现L100I(TTA→ATA)突变,在第12代又变成100M(ATA→ATG),L100M是不常见的突变形式,其对HIV NNRTIs耐药的影响未见报道,在第10代还同时出现了对NNRTIs高度耐药的Y188C(TAT→TGT)突变。JB26在第10代出现了L100I(TTA→ATA)突变。JB25和JB26在体外容易产生耐药性,而对JB26耐药比JB25要困难,导致耐药的主要基因突变发生在病毒逆转录酶基因的188和100位密码子。