缺陷病毒载体系统的研究进展

近年来缺陷病毒载体系统在基因治疗和许多基础研究中发挥着越来越重要的作用.本文将对几种主要的缺陷病毒载体系统、包装细胞及其在基因治疗方面的应用作一综述.

携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的 :构建携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,采用平末端连接法获得含人TGFβ1cDNA3’ -端活性肽编码基因正、反向插入的重组病毒质粒 ,脂质体介导转染包装细胞PA317,获得含TGFβ1正、反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ-AS ,感染NIH3T3细胞 ,测定病毒滴度。分别转染膀胱癌EJ细胞 ,通过Southern -blot和半定量RT -PCR方法评价载体整合及表达效率。结果 :pRevTβ、pRevTβ-AS载体病毒滴度分别为0.84、0.88×105CFU/ml,EJ细胞外源基因的整合率为100 %,正、反义基因转染细胞内TGFβ1mRNA的相对转录水平为1.89和0.35。结论 :构建的携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体符合细胞体外转染要求 ,能与肿瘤细胞高效整合 ,有效表达。

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.

携带内皮抑素复制缺陷型腺病毒载体的构建及其应用

目的构建鼠源性内皮抑素(mEndostatin)重组腺病毒真核表达载体,并将其转染胰腺癌细胞株,探讨其体外抑制血管形成的活性。方法 以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin,将mEndostatin连接到腺病毒载体pCA13中,构建pCA13-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过lipofectamine 2 000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo,用氯化铯密度梯度超速离心法纯化,用50％组织培养感染剂量法测定病毒滴度。体外转染胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3,并测定感染的胰腺癌细胞上清液mEndostatin的表达及观察其抑制血管形成的活性。结果 扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为6.3×1010pfu／ml,体外能高效转染胰腺癌细胞株,可分泌表达有抑制血管形成活性的mEndostatin。结论本实验所构建的mEndostatin重组腺病毒表达载体能有效表达具有生物活性的mEndostatin,为体内胰腺癌的基因治疗奠定了基础。

抗TNFα单链抗体复制缺陷型腺病毒载体的构建及表达

目的:构建pAd/CMV/V5-DEST-TNFα-scFv重组腺病毒载体,通过病毒包装、纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并对TNFα-scFv进行表达、鉴定.方法:以携带TNFα-scFv基因的载体PUC57-Amp为模板,扩增TNFα-scFv目的基因,构建穿梭质粒pDONR221-TNFα-scFv,测序证实质粒含有目的基因.与骨架质粒pAd-CMV-V5-DEST腺病毒骨架载体进行同源重组,形成表达克隆pAd/CMV/V5-DEST-TNFα-scFv.表达克隆转染293细胞,包装重组腺病毒,并鉴定和病毒滴定.结果:TNFα-scFv基因成功克隆到腺病毒载体中,转染293细胞后成功包装出重组腺病毒,病毒滴度为2.5×1011TCID50/mL,Western blot检测到TNFα-scFv基因在293细胞中高水平表达.结论:成功构建了带有TNFα-scFv基因的重组腺病毒载体,为进一步研究提供实验基础.

体内复制缺陷型腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶基因转染胶质瘤细胞对5-氟胞嘧啶敏感

病毒介导的化学敏感基因的转染,为肿瘤的治疗提供了一条有希望的新途径,目前脑肿瘤的基因治疗集中在将包装携带TK基因的逆转录病毒的细胞系植入肿瘤,其主要局限性是逆转录病毒在体内的转染几乎无效,即只有和包装细胞非常接近的胶质瘤细胞才易被转染,且TK基因疗法所产生的旁观者效应需依赖细胞间的直接接触。本文介绍通过复制缺陷的腺病毒载体介导将细菌胞嘧啶脱氨酶(cd)基因转染至大鼠9L胶质瘤细胞,使其对在正常细胞没有毒性的核苷-5-氟胞嘧啶(5-Fc)敏感。

负载hTERT调控相关miR-138复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138前体全长cDNA(pre-miR-138)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR138)。方法 pre-miR-138全基因合成后插入腺病毒穿梭质粒(pDC315-miR138),与腺病毒包装质粒pBHGloxDel-taE1、3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Ad-miR138并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Ad-miR138进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/mL。电镜可见病毒在HEK293细胞中大量复制。PCR双引物鉴定Ad-miR138可扩增出Ad及pre-miR-138特异片段,而对照Ad-LacZ只能扩增出Ad特异片段,不能扩增出pre-miR-138特异片段。结论成功包装了负载miR-138全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究微RNAs(microRNAs)在肿瘤发生、发展中的作用,以及hTERT调控相关miR-138在肿瘤治疗中的价值奠定了基础。

负载肝素酶复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人肝素酶(hpa)全长cDNA的复制缺陷型腺病毒载体(Adhpa)。方法将肝素酶正义腺病毒穿梭质粒pDC315hpa与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Adhpa,并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Adhpa进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/ml。电镜证实病毒浓缩液中存在病毒颗粒,并可见病毒在HEK293细胞中复制。PCR双引物鉴定Adhpa可扩增出Ad及hpa特异片段,而对照则不能扩增出hpa片段。结论成功包装了负盘。

逆转录病毒载体介导的转基因鸡研究进展

转基因鸡作为重要的经济动物和理想的生物反应器,具有广阔的应用前景。鸡基因组测序的完成加快了转基因鸡的研究和发展。病毒载体法是转基因鸡制备的主导方法之一,具有效率高和遗传稳定性良好的优势。本文对逆转录病毒载体特征、复制缺陷型病毒载体和复制整合双缺陷型病毒载体的优缺点及其介导的转基因鸡研究进行综述,展望人工核酸酶技术结合复制整合双缺陷型逆转录病毒载体在转基因鸡研究领域的应用前景。

负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响

目的探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达。方法 将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测BGC-823细胞内miR-138和hTERT mRNA的表达丰度;Western Blot检测hTERT蛋白表达。结果 与阴性对照腺病毒相比,负载miR-138的腺病毒感染BGC-823细胞后,可显著提高miR-138表达丰度(P<0.05);而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞相比,感染负载人miR-138腺病毒(Ad-miR138)的BGC-823细胞内hTERT蛋白表达有所下调。结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可有效上调hTERT调控相关miR-138的表达丰度,进而可有效抑制miR-138靶基因hTERT的表达水平。

腺病毒载体介导人KDR胞外段诱导抗小鼠肝癌的免疫效应

目的:探讨复制缺陷型腺病毒载体(Ad)介导人血管内皮细胞生长因子受体-2(hVEGFR-2或hKDR)胞外段诱导抗小鼠肝癌血管免疫及打破免疫耐受的效果。方法:构建Ad hKDRE,用Ad hKDRE皮内免疫C57BL/6小鼠,7d后取脾细胞作为效应细胞(E),Hepa1-6/mKDR作为靶细胞(T),行乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测特异性CTL杀伤活性;给免疫小鼠接种肝癌细胞Hepa1-6,观察荷瘤小鼠成活情况。结果:Ad hKDRE免疫小鼠1周后,在E∶T为100∶1、50∶1和25∶1时,Ad hKDRE诱导的6hCTL杀伤率分别为(81.5±5.6)%、(68.4±5.5)%和(39.6±3.9)%。Ad hKDRE免疫小鼠1周后接种2×106 Hepa1-6肝癌细胞,观察2个月无小鼠成瘤;接种5×106 Hepa1-6细胞,小鼠无瘤成活率为60%。上述CTL效应和抗成瘤作用在清除CD8+和CD4+ T淋巴细胞后消失。结论:Ad介导异种(人)KDR胞外段能有效地打破小鼠肝癌的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,这种特异性细胞免疫反应是CD4+和CD8+ T细胞依赖性的。

负载人miR-29a复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的包装负载人miR-29a前体全长cDNA(pre-miR-29a)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR29a)。方法将pre-miR-29a全基因合成后,插入腺病毒穿梭质粒pDC315,与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE13、Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装重组慢病毒Ad-miR29a,扩增、收集并纯化。对纯化后的Ad-miR29a进行滴度测定、感染性鉴定及PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×109 pfu/ml。PCR鉴定Ad-miR29a可扩增出pre-miR-29a特异片段,而对照Ad-LacZ不能扩增出pre-miR-29a特异片段。Ad-miR29a感染人胃癌SGC-7901细胞后,可明显提高miR-29a的表达丰度。结论成功包装了负载miR-29a的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究microRNAs在肿瘤发生发展中的作用,以及miR-29a在肿瘤治疗中的价值奠定了基础。

重组腺病毒介导绿色荧光蛋白基因对小鼠眼组织的转染和表达

目的研究不同剂量Ad5-EGFP前房注射后,报告基因在小鼠眼部组织的表达情况及分布特点。方法24只BALB/c小鼠随机分组。实验组以不同浓度梯度前房注射Ad5-EGFP。对照组前房分别注射PBS和不给予任何注射。观察活体眼部组织EGFP表达情况及阳性细胞的类型。结果低浓度注射组在各个时间点眼表均未观察到EGFP荧光表达。高浓度注射组在注射病毒第1d即可以观察EGFP的表达,在第10d时眼表EGFP荧光亮度、范围增加最为明显。EGFP在角膜内皮细胞、虹膜色素上皮细胞及小梁网阳性表达。结论Ad5型腺病毒载体定向携带报告基因在眼前节表达,为眼前节疾病的基因治疗提供了实验依据。

携TGFβ1正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用

目的 :探讨表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体 ,对人膀胱癌细胞生长及细胞周期调控的作用。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,构建表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ AS ;分别转染膀胱癌细胞株EJ ,观察不同载体对膀胱癌细胞体外增殖、克隆形成和细胞周期时相的影响。结果 :pRevTβ、pRevTβ AS载体病毒滴度分别为 0 84、0 88× 10 5CFU/ml,对EJ细胞的整合率为10 0 % ,并有效表达 ;抑制TGFβ1表达可以降低靶细胞的生长速度和克隆形成率 ,同时出现G0 /G1期细胞比例增高和S期细胞比例降低。结论 :携TGFβ1反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体可以下调EJ细胞内源性TGFβ1表达 ,诱导肿瘤细胞G1期阻滞 ,抑制肿瘤细胞体外生长增殖。

小鼠白细胞介素-15基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

我们利用转基因技术体外构建表达小鼠白细胞介素．15（mIL-15）基因的复制缺陷型腺病毒载体，为研究mIL-15基因修饰树突状细胞（DC）诱导肿瘤免疫反应奠定基础。

腺病毒载体纤突结的改造及改造后的特性研究

目的:采用一种简便方法在复制缺陷型腺病毒载体纤突结(fibre knob)的HI loop插入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartate,RGD)肽,构建纤突结修饰的腺病毒载体,观察其对RD和T24肿瘤细胞的感染效率以及机体针对外源基因的抗体反应。方法:以PCR方法将RGD插入到pAdEasy-1后,通过常规方法构建可表达EGFP和人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialviruse,RSV)密码子优化型融合蛋白(fusion protein,Fsyn)的腺病毒载体FGAd-RGD-EGFP和FGAd-RGD-Fsyn。用FGAd-RGD-EGFP感染RD和T24肿瘤细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率,用FGAd-RGD-Fsyn免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测针对外源基因的抗体反应。结果:与FGAd-EGFP相比,FGAd-RGD-EGFP对RD和T24肿瘤细胞的感染效率都有显著提高,EGFP表达效率也明显增强。与FGAd-Fsyn相比,FGAd-RGD-Fsyn所引起的机体针对外源基因的抗体反应并无差异。结论:改造后的腺病毒载体能显著提高对RD和T24肿瘤细胞的感染效率,但并不引起机体产生针对外源基因的增强的抗体反应,该载体能用于肿瘤等疾病的基因治疗研究。

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在C57BL/6小鼠淋巴细胞中的表达

目的通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测定淋巴细胞培养上清液中白介素2的水平。MTT法测定活细胞数目,以了解活化的C57BL/6小鼠淋巴细胞对B16细胞的杀伤效应。结果加入不同滴度的重组腺病毒颗粒后,C57BL/6小鼠淋巴细胞明显增殖;同时淋巴细胞培养上清液中白介素2水平也明显增加。重组腺病毒颗粒转染的C57BL/6小鼠淋巴细胞可明显杀伤B16细胞,效/靶比越高,杀伤效应越明显。结论SEA基因可以在C57BL/6小鼠淋巴细胞中表达,并且表达产物能够活化C57BL/6小鼠淋巴细胞,进而杀伤B16细胞。