鸡胚中人工感染网状内皮增殖病病毒的检测

为了模仿禽网状内皮增生病毒(REV)垂直感染鸡胚,在1和3日龄的发育SPF鸡胚人工接种不同剂量的REV,并继续孵化至12日龄。在将发育鸡胚制成成纤维细胞单层后,再用抗REV单克隆抗体11B118作间接荧光抗体反应检测REV。结果表明,从所有人工感染REV的鸡胚12日龄制备的成纤维细胞中均能在培养48h检测出REV。该方法可用于检测生产弱毒疫苗的SPF鸡胚及其相应细胞有无REV的污染。

IFN-α对禽网状内皮组织增殖病病毒体内外增殖的抑制作用

为明确禽源α干扰素(IFN-α)对禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)体内外增殖的抑制效果,本试验在细胞和动物水平上分别采用鸡胚成纤维(DF-1)细胞和海兰褐鸡作为模型,于REV接种前(预防)和接种后(治疗)分别添加不同浓度的禽IFN-α处理,分析禽IFN-α在体外和体内对REV增殖的影响。体外试验结果显示,与阳性对照组相比,禽IFN-α浓度为33 IU/mL的治疗组72 h细胞和上清中REV的增殖受到了显著抑制(P<0.05),禽IFN-α浓度为33 IU/mL的预防组72 h细胞中REV的增殖受到了显著抑制(P<0.05)。通过比较各组海兰褐鸡的平均体重、血液中REV阳性率和病毒载量、泄殖腔REV阳性率和排毒量、免疫器官指数和病毒载量系统评估禽IFN-α对REV体内增殖的影响,结果显示,与阳性对照组相比,禽IFN-α浓度为1 500 IU的治疗组海兰褐鸡21和28日龄时体重显著升高(P<0.05),14日龄时肝脏发育指数以及14和28日龄时的脾脏发育指数显著降低(P<0.05),14日龄时血液和脾脏中病毒载量显著降低(P<0.05),7和21日龄时泄殖腔排毒量显著降低(P<0.05)。本试验在体外细胞和体内动物2个层面均证实了禽IFN-α对REV增殖具有显著的抑制效果,这不仅为禽网状内皮组织增殖病的防控策略提供了新的思路和辅助手段,也为未来抗病毒药物的研发和应用提供了科学依据。

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。

网状内皮组织增殖病病毒免疫抑制状态下禽波氏菌对雏鸡致病性增强

禽波氏菌可引起禽类的高度接触性上呼吸道疾病,且经常与免疫抑制性病毒发生共感染。为研究免疫抑制状态下禽波氏菌致病性的变化,试验中以网状内皮组织增殖病病毒(REV)感染鸡胚构建雏鸡的免疫抑制状态,雏鸡孵出后再经呼吸道感染禽波氏菌,模拟临床二者的混合感染。分别监测混合感染与单纯感染条件下雏鸡的生长状况、免疫器官指数、NDV灭活苗免疫抗体水平、禽波氏菌抗体水平、禽波氏菌入侵组织时间、组织病理学变化以及其他细菌的继发感染状况等。结果发现REV感染可导致雏鸡严重的生长抑制和免疫抑制作用,感染禽波氏菌后使抑制作用加重,且干扰了针对禽波氏菌的抗体的产生。禽波氏菌在REV免疫抑制状态雏鸡肝、心和肾中的检出时间比单纯感染组提前了1d。混合感染组雏鸡气管黏膜完全脱落,肝、心等组织内细胞广泛性坏死,细菌继发感染病例数增多。REV免疫抑制状态下,机体防御体系被破坏,对禽波氏菌的免疫应答降低,为禽波氏菌在组织中的侵袭扩散提供了便利,使禽波氏菌对雏鸡的致病性增强。

不同方法对网状内皮组织增殖病病毒的检测

从山东、江苏、上海等地的鸡场中 ,收集疑为网状内皮组织增殖病病毒 (REV)感染鸡的脾脏、肝脏 5 6份 ,分别通过聚合酶链式反应 (PCR)、班点杂交试验 (Dot- blot)和间接免疫荧光试验 (IFA)对其进行 REV检测。结果有 2 1份呈PCR阳性 ,2 0份呈 Dot- blot阳性 ,15份呈 IFA阳性 ,且所有 IFA阳性样品 ,PCR和 Dot- blot检测都呈阳性 ,2 0份Dot- blot阳性样品中有 19份呈 PCR阳性。研究表明 ,PCR检测 REV较其他方法敏感 ,可作为 REV的常规检测方法之一。

网状内皮组织增殖病病毒(REV)不同分离株LTR基因的序列分析

从山东、江苏的几个大型鸡场收集疑为REV感染的鸡脾脏、肝脏 ,提取组织DNA ,并以此为模板 ,通过PCR技术 ,从山东泰安及江苏海安的某鸡场中分别扩增到REV的LTR基因。将该基因克隆进TA载体中 ,转化大肠杆菌TG1,经酶切鉴定 ,得到了两株REVLTR基因的克隆 ,标记为SD和HA。将所得克隆测序并与国外报道的REVLTR基因进行比较 ,发现国内分离株与国外株有

禽网状内皮组织增殖病病毒的实时荧光定量PCR检测

基于Light Cycler平台,利用SYBR GreenI染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性,建立了一种荧光PCR方法检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。整个检测过程2 h内可以完成,病毒的最低检出浓度为10-7,在特异性试验中,REV有特异性的扩增曲线,而禽流感病毒和阴性对照一样,没有特异性扩增。对REV患鸡各器官组织进行了荧光PCR检测,各脏器病毒含量从高到低依次是肝、脾、腺胃、肾、肌胃,肝脏中的病毒含量最高,肌胃中的病毒含量最少,肺中没有检测到病毒。基于SYBR GreenI的荧光PCR方法检测REV快速、敏感、特异性好,为开展REV病原学检测提供了一种快速、无污染的方法。

聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。

禽网状内皮组织增殖病病毒GD09株的分离与全基因组测序

从广东某鸡场送检的疑似禽网状内皮组织增殖病的病鸡中采集病料,处理后经接种DF-1细胞,经聚合酶链式反应(PCR)及特异性间接免疫荧光试验(IFA),分离并鉴定出1株禽网状内皮组织增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV),命名为GD09。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8295bp,符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp90基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较分析,结果表明,GD09分离株与中国分离株HA9901亲缘关系最近,核苷酸相似性最高。

禽网状内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能

通过PCR方法,将禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点(MCS)的EcoRI和SacI之间,并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到SphI和HindⅢ之间,构建成重组质粒pUC-LTR。将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中,获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90。重组质粒经转染48h,能够检测到外源基因的表达。本研究提示,REVLTR能够作为启动子构建表达质粒。

禽网状内皮组织增殖病病毒对禽流感疫苗免疫效果的影响

为研究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)对禽流感病毒(AIV)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔感染REV HLJR0901株后,分别于10日龄免疫重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6)、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-6)及10日龄和24日龄两次免疫r LH5-6疫苗,并设未感染REV的免疫对照组,于免疫后检测血清HI抗体,并采用H5N1亚型高致病性AIV攻毒。结果显示:实验鸡感染REV后HI抗体滴度均低于相应的未感染REV的免疫对照组。感染REV后,免疫一次Re-6灭活疫苗、r LH5-6活疫苗及两次r LH5-6活疫苗的实验鸡攻毒后的存活率分别为70%、60%及80%,排毒鸡数分别为4/10、4/10及3/10;未感染REV的免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒;空白对照组实验鸡攻毒后3 d内全部死亡并且排毒。本研究表明,REV对AIV灭活疫苗和活疫苗均具有明显的免疫抑制作用,加强免疫r LH5-6疫苗可以部分减轻该抑制作用。

蛋鸡网状内皮组织增生病病毒分离鉴定

山东某鸡场饲养的10000只父母代海兰蛋种鸡于育成前期出现进行性消瘦、生长发育不良等症状;剖检以腺胃肿胀、淋巴器官萎缩为特征,至70日龄发病率达90%;经ELISA方法检测抗体及间接免疫荧光原位病原检测证明该病与网状内皮组织增殖病病毒(REV)感染有关。取7只病鸡肝脏研磨处理后接种鸡胚成纤维细胞(CEF),用REV单抗11B118进行间接免疫荧光检测,结果均呈阳性;根据REV-HA株前病毒基因组DNA env囊膜糖蛋白基因序列设计引物,提取阳性CEF基因组DNA作为模版,PCR扩增后得到438 bp的目的片段;PCR产物测序结果比对显示,该毒株与其他中国野毒株的同源性高于与REV-HA株的同源性。综合诊断判定该病可能与鸡群早期感染致病力较强的REV有关。

肉鸡感染禽网状内皮组织增殖病的诊断及流行病学分析

禽网状内皮组织增殖病病毒（REV）引起鸡、鸭、鹅、火鸡及其它禽类的网状内皮组织增殖病（RE），它是以急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤形成为特征的一群病理综合征，由于病毒引起的肿瘤以网状组织增生为特征，因此称为禽网状内皮组织增殖病。

禽网状内皮组织增生病病毒囊膜蛋白基因的克隆及其原核表达

以本实验室保存的REV毒株为模板,采用RT_PCR技术扩增了REV env部分基因,长为939 bp,并进行亚克隆到pMD18_T质粒载体上,连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒pET_env,将目的片段进行序列分析,结果表明,该REV的env基因与已发表的SNV株、中国HA9901株以及A株同源性均达94%以上,推导的氨基酸同源性为94%以上。将该基因片段与原核表达载体pET_32a重组,并将重组质粒转化至宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS_PAGE电泳,免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,表达产物与理论推理一致;免疫印迹结果证明,表达的env蛋白可被REV阳性血清所识别。

禽网状内皮组织增殖病的实验室诊断

经剖检观察到病鸡脏器上的肿瘤结节,病理组织学检查到心、肝、脾、肺、肾、肠等组织中有大量网状细胞增生。免疫组织化学检测到病变组织中有REV抗原。因此,将组织学病理变化和检测禽网状内皮组织增殖病病毒相结合可以作为实验室快速、准确诊断禽网状内皮组织增殖病的方法。

1例规模化种鸡场鸡呼肠孤病毒、网状内皮组织增殖病病毒混合感染的诊断

目前，规模化养殖场尽管非常重视病毒性疾病的免疫预防，但马立克氏病、禽白血病、网状内皮组织增殖病、呼肠孤病毒病等依然存在，严重影响着机体免疫系统作用的发挥，是造成多种疾病继发感染、种鸡生产性能下降、经济效益锐减的重要因素。2013年6月，江苏某种鸡场出现鸡群发育不良、羽毛粗乱、下痢等临床症状，经实验室检查诊断为禽呼肠孤病毒和网状内皮组织增殖病病毒混合感染所致。

一例蛋鸡禽网状内皮组织增殖病和禽白血病混合感染的诊治

某蛋鸡场80日龄蛋鸡出现渐进性消瘦和生长发育不良,剖检可见腺胃肿大,乳头挤压出现脓性分泌物。无菌取病死鸡的腺胃进行荧光定量RT-PCR/PCR检测,结果显示该样品禽网状内皮组织增殖病病毒、禽白血病病毒均为阳性。结合临床症状、剖检病变和实验室检测结果,该蛋鸡场发病的原因是由禽网状内皮组织增殖病病毒和禽白血病病毒混合感染而引起的。