IFN-α对禽网状内皮组织增殖病病毒体内外增殖的抑制作用

为明确禽源α干扰素(IFN-α)对禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)体内外增殖的抑制效果,本试验在细胞和动物水平上分别采用鸡胚成纤维(DF-1)细胞和海兰褐鸡作为模型,于REV接种前(预防)和接种后(治疗)分别添加不同浓度的禽IFN-α处理,分析禽IFN-α在体外和体内对REV增殖的影响。体外试验结果显示,与阳性对照组相比,禽IFN-α浓度为33 IU/mL的治疗组72 h细胞和上清中REV的增殖受到了显著抑制(P<0.05),禽IFN-α浓度为33 IU/mL的预防组72 h细胞中REV的增殖受到了显著抑制(P<0.05)。通过比较各组海兰褐鸡的平均体重、血液中REV阳性率和病毒载量、泄殖腔REV阳性率和排毒量、免疫器官指数和病毒载量系统评估禽IFN-α对REV体内增殖的影响,结果显示,与阳性对照组相比,禽IFN-α浓度为1 500 IU的治疗组海兰褐鸡21和28日龄时体重显著升高(P<0.05),14日龄时肝脏发育指数以及14和28日龄时的脾脏发育指数显著降低(P<0.05),14日龄时血液和脾脏中病毒载量显著降低(P<0.05),7和21日龄时泄殖腔排毒量显著降低(P<0.05)。本试验在体外细胞和体内动物2个层面均证实了禽IFN-α对REV增殖具有显著的抑制效果,这不仅为禽网状内皮组织增殖病的防控策略提供了新的思路和辅助手段,也为未来抗病毒药物的研发和应用提供了科学依据。

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。

3种方法检测禽网状内皮组织增殖病毒人工感染鸡胚孵化雏鸡的带毒比较

为比较血液和粪便等样品采用不同方法检测禽网状内皮组织增殖病毒(REV)的准确率,从而为制定禽网状内皮组织增殖病(RE)净化程序提供参考,利用鸡胚卵黄囊接种构建REV垂直传播感染雏鸡模型,分别采用DF-1细胞病毒分离、RT-PCR检测和荧光定量RT-PCR检测,对1日龄雏鸡血液和胎粪样品,7~70日龄鸡(每隔1周)的血液和泄殖腔棉拭子样品,进行REV检测和结果比较。结果显示:对1日龄出壳的SPF鸡血浆进行检测,荧光定量RT-PCR灵敏度最高,阳性检出率为100%(25/25),其次为病毒分离,阳性检出率为96%(24/25),RT-PCR检出率最低;对1日龄出壳的SPF鸡胎粪进行检测,荧光定量RT-PCR与病毒分离灵敏度一致,阳性检出率均为80%(20/25),RT-PCR检出率最低,为28%(7/25)。对7~70日龄鸡(每隔1周)进行血液和泄殖腔棉拭子检测,3种方法阳性检出率与1日龄检测情况总体相似,检出率从高到低依次为荧光定量RT-PCR、病毒分离和RT-PCR。结果表明,在同一检测时间点使用同一检测方法,胎粪/泄殖腔棉拭子REV阳性检出率基本低于血液检出率。本研究初步比较了不同方法检测REV人工感染鸡胚孵化雏鸡的带毒情况,为实施REV净化奠定了基础。

网状内皮组织增殖病病毒(REV)不同分离株LTR基因的序列分析

从山东、江苏的几个大型鸡场收集疑为REV感染的鸡脾脏、肝脏 ,提取组织DNA ,并以此为模板 ,通过PCR技术 ,从山东泰安及江苏海安的某鸡场中分别扩增到REV的LTR基因。将该基因克隆进TA载体中 ,转化大肠杆菌TG1,经酶切鉴定 ,得到了两株REVLTR基因的克隆 ,标记为SD和HA。将所得克隆测序并与国外报道的REVLTR基因进行比较 ,发现国内分离株与国外株有

禽网状内皮组织增殖病毒(REV)诊断技术研究进展

禽网状内皮组织增殖病是由反转录病毒科的网状内皮组织增殖病病毒群引起的鸡、鸭、火鸡和其它禽类的一组肿瘤性综合征。诊断RE不仅需要见到典型的肉眼和组织学病变,而且需要证明REV的存在。本文介绍了国内外禽网状内皮组织增殖病毒的诊断技术的研究现状与进展。

禽网状内皮组织增殖病病毒的实时荧光定量PCR检测

基于Light Cycler平台,利用SYBR GreenI染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性,建立了一种荧光PCR方法检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。整个检测过程2 h内可以完成,病毒的最低检出浓度为10-7,在特异性试验中,REV有特异性的扩增曲线,而禽流感病毒和阴性对照一样,没有特异性扩增。对REV患鸡各器官组织进行了荧光PCR检测,各脏器病毒含量从高到低依次是肝、脾、腺胃、肾、肌胃,肝脏中的病毒含量最高,肌胃中的病毒含量最少,肺中没有检测到病毒。基于SYBR GreenI的荧光PCR方法检测REV快速、敏感、特异性好,为开展REV病原学检测提供了一种快速、无污染的方法。

不同方法对网状内皮组织增殖病病毒的检测

从山东、江苏、上海等地的鸡场中 ,收集疑为网状内皮组织增殖病病毒 (REV)感染鸡的脾脏、肝脏 5 6份 ,分别通过聚合酶链式反应 (PCR)、班点杂交试验 (Dot- blot)和间接免疫荧光试验 (IFA)对其进行 REV检测。结果有 2 1份呈PCR阳性 ,2 0份呈 Dot- blot阳性 ,15份呈 IFA阳性 ,且所有 IFA阳性样品 ,PCR和 Dot- blot检测都呈阳性 ,2 0份Dot- blot阳性样品中有 19份呈 PCR阳性。研究表明 ,PCR检测 REV较其他方法敏感 ,可作为 REV的常规检测方法之一。

禽网状内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能

通过PCR方法,将禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点(MCS)的EcoRI和SacI之间,并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到SphI和HindⅢ之间,构建成重组质粒pUC-LTR。将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中,获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90。重组质粒经转染48h,能够检测到外源基因的表达。本研究提示,REVLTR能够作为启动子构建表达质粒。

网状内皮组织增殖病病毒免疫抑制状态下禽波氏菌对雏鸡致病性增强

禽波氏菌可引起禽类的高度接触性上呼吸道疾病,且经常与免疫抑制性病毒发生共感染。为研究免疫抑制状态下禽波氏菌致病性的变化,试验中以网状内皮组织增殖病病毒(REV)感染鸡胚构建雏鸡的免疫抑制状态,雏鸡孵出后再经呼吸道感染禽波氏菌,模拟临床二者的混合感染。分别监测混合感染与单纯感染条件下雏鸡的生长状况、免疫器官指数、NDV灭活苗免疫抗体水平、禽波氏菌抗体水平、禽波氏菌入侵组织时间、组织病理学变化以及其他细菌的继发感染状况等。结果发现REV感染可导致雏鸡严重的生长抑制和免疫抑制作用,感染禽波氏菌后使抑制作用加重,且干扰了针对禽波氏菌的抗体的产生。禽波氏菌在REV免疫抑制状态雏鸡肝、心和肾中的检出时间比单纯感染组提前了1d。混合感染组雏鸡气管黏膜完全脱落,肝、心等组织内细胞广泛性坏死,细菌继发感染病例数增多。REV免疫抑制状态下,机体防御体系被破坏,对禽波氏菌的免疫应答降低,为禽波氏菌在组织中的侵袭扩散提供了便利,使禽波氏菌对雏鸡的致病性增强。

禽网状内皮组织增殖病病毒GD09株的分离与全基因组测序

从广东某鸡场送检的疑似禽网状内皮组织增殖病的病鸡中采集病料,处理后经接种DF-1细胞,经聚合酶链式反应(PCR)及特异性间接免疫荧光试验(IFA),分离并鉴定出1株禽网状内皮组织增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV),命名为GD09。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8295bp,符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp90基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较分析,结果表明,GD09分离株与中国分离株HA9901亲缘关系最近,核苷酸相似性最高。

聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。

昆虫细胞表达的网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白及其免疫性

利用Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystems构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重组杆状病毒。用REV特异性单克隆抗体分别做间接免疫荧光抗体试验(IFA)和免疫转印试验,均可从感染的Sf9昆虫细胞中检出REVenv。重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解后制备成油乳疫苗免疫SPF鸡后,可以诱发维持45d以上的特异性抗REV抗体,并可抵抗REV病毒感染。

网状内皮组织增殖病病毒感染鸡红细胞免疫功能的动态变化

对１日龄ＳＰＦ鸡分别腹腔接种３株禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）的ＲＥＶ－Ｔ，ＤＩＡ和Ｃ４８株，测得试验鸡红细胞补体（Ｃ３ｂ）受体花环率自接种后１１ｄ起显著低于对照组；而红细胞免疫复合物（ＩＣ）花环率从接种后２５ｄ起（３２ｄ除外），又显著高于对照组。接种不同ＲＥＶ毒株的鸡红细胞Ｃ３ｂ受体花环率和ＩＣ花环率的变化程度不一致，表明不同毒株引起的免疫抑制程度不同。

禽网状内皮组织增殖病病毒感染鸡的外周血白细胞动态变化

３２只１日龄ＳＰＦ鸡随机分为３个试验组和１个对照组。试验组分别腹腔接种３株禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ－Ｔ、ＲＥＶ－ＤＩＡ和ＲＥＶ－Ｃ４５），０．５ｍＬ／羽；对照组注射等量生理盐水。在不同时期检测感染鸡外周血白细胞数的动态变化。结果发现，各试验组鸡的白细胞总数和异嗜性白细胞百分率及总数均呈先升高后降低的趋势；淋巴细胞百分率先降低后升高，而淋巴细胞总数则在接种后第３天显著（Ｐ＜０．０１）高于对照组，第１０天起则显著低于对照组。各试验组间白细胞数的变化不尽相同。

禽网状内皮组织增生病病毒感染SPF雏鸡血液淋巴细胞增殖功能及其细胞周期相关因子变化

为探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染对SPF雏鸡外周血液的淋巴细胞增殖功能及其细胞周期素D1、p27表达的影响。将80只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和对照组,应用CCK-8、RT-qPCR、Western Blot等方法对雏鸡外周血液上述被检指标的动态变化进行检测。结果表明,REV感染SPF雏鸡后,其外周血液中T、B淋巴细胞增殖能力明显低于对照组雏鸡,且p27mRNA水平显著(P<0.05)高于对照组雏鸡;病毒感染后期Cyclin D1mRNA表达及其蛋白质含量均显著高于(P<0.05)对照组雏鸡,然而p27转录显著低于对照组雏鸡(P<0.05)。REV感染SPF雏鸡导致的血液T、B细胞增殖能力下降、Cyclin D1mRNA转录及其蛋白质含量的增加而p27mRNA转录下降与REV感染所致的雏鸡免疫机能下降密切相关。

禽网状内皮组织增殖病病毒对禽流感疫苗免疫效果的影响

为研究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)对禽流感病毒(AIV)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔感染REV HLJR0901株后,分别于10日龄免疫重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6)、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-6)及10日龄和24日龄两次免疫r LH5-6疫苗,并设未感染REV的免疫对照组,于免疫后检测血清HI抗体,并采用H5N1亚型高致病性AIV攻毒。结果显示:实验鸡感染REV后HI抗体滴度均低于相应的未感染REV的免疫对照组。感染REV后,免疫一次Re-6灭活疫苗、r LH5-6活疫苗及两次r LH5-6活疫苗的实验鸡攻毒后的存活率分别为70%、60%及80%,排毒鸡数分别为4/10、4/10及3/10;未感染REV的免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒;空白对照组实验鸡攻毒后3 d内全部死亡并且排毒。本研究表明,REV对AIV灭活疫苗和活疫苗均具有明显的免疫抑制作用,加强免疫r LH5-6疫苗可以部分减轻该抑制作用。

SPF雏鸡人工感染禽网状内皮组织增殖病病毒后肝组织的超微结构观察

通过对１日龄ＳＰＦ雏鸡进行人工接种禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ），观察其肝脏组织在透射电镜下细胞器的变化，接种ＲＥＶ后７～１４ｄ，出现线粒体嵴变短、断裂膨大、排列紊乱、细胞核浓缩、核碎裂等。雏鸡感染ＲＥＶ后２１～４２ｄ，线粒体急性肿胀，嵴很多消失呈现空泡化，线粒体内出现包涵体，粗面内质网网池扩大，网状结构断裂呈单个囊泡状，细胞核溶解，坏死，出现髓样小体，细胞间胶原纤维增多，网状细胞增殖。