基于454 GSFLX高通量测序的芒果微卫星标记特征分析

【目的】研究芒果基因组SSR的总体特征，开发芒果SSR标记，为SSR标记在芒果种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。【方法】利用新一代454GSFLX高通量测序技术结合SSR文库构建法，得到19611条无冗余的序列，对其进行SSR搜索，共获得8831条SSR。利用Primer5．0软件设计SSR引物，并以筛选的引物对24份芒果种质进行多样性分析。【结果】在芒果SSR中，二核苷酸（5980个SSR）和三核苷酸（2451个SSR）占主导地位，所占比例分别为67，85％和27，81％；出现频率最高的二核苷酸重复基元是AC／GT，占总数的17．94％，出现最高的三核苷酸重复基元为TTC／GAA，占5．07％。随机选择50个SSR位点合成引物，经24份芒果种质筛选鉴定，21对引物可扩增获得产物，有效扩增率为42．00％；其中17对引物表现出良好多态性，占有效引物的80．95％，占总引物的34．00％。在17对多态性引物中，每对引物扩增等位基因数2—12个，产生的多态性片段为2-7个，多态性比例为50％-100％。【结论】454GSFLX高通量测序开发SSR引物有较好的实用性，开发获得的17个具有多态性的芒果SSR标记可用于研究芒果及其相关近缘物种的遗传变异。

基于454高通量测序的黄土高原不同乔木林土壤细菌群落特征

选取黄土高原不同乔木林(辽东栎,LDL;侧柏,CB;刺槐,CH;油松,YS)表层土壤为研究对象,利用第二代高通量测序技术罗氏454平台对其进行16SrRNA基因V1~V3可变区测序,通过分析其Alpha多样性、物种组成和丰度、群落结构,结合土壤的理化性质研究其对细菌群落结构的影响.结果表明:所有土壤样品共检测到36个门,84个纲,187个目.不同乔木林土壤中优势菌来自变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌(Chloroflexi)和浮霉菌门(Planctomycetes),主要的优势菌纲为放线杆菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、酸杆菌(Acidobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetacia).不同乔木林土壤中绿弯菌门(Chloroflexi)与pH值呈极显著的正相关,总磷和蓝细菌(Cyanobacteria)呈极显著的正相关,微生物生物量碳与芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)呈极显著的负相关,土壤总磷含量可能为CB样地区别于其他土样群落组成的主要因素.LDL样地细菌群落受环境影响较小.

高通量测序在罗氏沼虾抗病力比较中的应用

为了比较4个罗氏沼虾抗病选育群体(A、B、C、D)的抗病性能,对4个罗氏沼虾选育群体和1个非选育群体(E)进行了溶藻弧菌肌肉注射感染试验,运用高通量测序方法比较不同罗氏沼虾群体间感染组和对照组肌肉组织中弧菌的变化情况,根据感染成活率的差异性,分析其中3个罗氏沼虾群体(A、C、E)肠道组织和养殖水体的菌群多样性。结果表明:肌肉组织样品中微生物主要分为6个门,其中厚壁菌门占绝对优势,次优势门为变形菌门,软壁菌门和酸杆菌门的含量相对较低;各感染组芽孢杆菌属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属的含量都高于对照组,而乳球菌属、乳酸杆菌属的含量明显低于对照组;肠道组织和养殖水体中微生物主要分为3个门,分别是变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门;基于不同罗氏沼虾群体肌肉组织中不同时间段内溶藻弧菌的含量,5个群体的抗弧菌感染能力分别为A>B>E>D>C,与感染成活率结果一致。综上,罗氏沼虾体内的菌群结构和养殖水环境密切相关,但相对独立;芽孢杆菌和类芽孢杆菌的含量差异可能是造成A群体和C群体感染成活率差异显著的原因。

用于Roche/454高通量测序的12个多重标签转录组文库的构建

利用第二代测序技术测定海洋生物转录组已成为揭示海洋生物分子生物学机制的重要工具.以长度为10nt的不同多重标签(multiplex identifier)进行区分,构建了杂色鲍(Haliotis diversicolor)、僧帽牡蛎(Saccostrea cucullata)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)3种海洋生物的12个多重标签转录组文库.以合适的比例对各文库进行混合,利用定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000等3种DNA浓度测定方法测定每个多重标签转录组文库的DNA浓度,3种方法的数值均一化并加权平均后,按照预定比例混合.为评估文库质量,先采用传统的Sanger测序测定了混合文库的192条序列,发现191条序列具有符合Roche/454高通量测序要求的AB格式,即一端为454A序列,另一端为454B序列;其中189条序列能分辨出其带有的多重标签;插入的平均长度为348bp.然后通过Roche/454的滴定测序获得了34642条序列,其中32872条序列(94.9%)能分辨出其带有的多重标签,能够精确地分配到12个转录组,并且利用滴定测序结果计算出每个转录组文库的真实比例,对定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000进行了评估,结果表明定量PCR是相对准确的定量方法.以上的评估表明所建立的转录组文库构建方法是稳定可靠的,可以广泛应用于转录组学研究.

基于454高通量测序平台血液、呼吸道、消化道临床样本的快速检测

目的探讨454高通量测序平台应用于临床样本快速检测的可能性。方法应用454高通量测序平台测定血液、呼吸道和消化道临床样本中微生物菌群的16S r DNA基因的V3-V4高变异区段序列,采用BLAST方法与RDP数据库进行比对,基于比对结果,获得不同种属的病原菌的所匹配的read数。结果 8份临床模拟样本中,7份检测出目标菌属,检出率为87.5%。在血液、肺泡灌洗液和咽拭子这类正常状态下的无菌体液,检测结果较为明确,检出的细菌较为集中,显示了检测结果的可靠性。而对本身含有较多种类细菌的粪便样本,其目标菌比例明显降低。结论实现了80 h内得到血液、呼吸道和消化道临床样本中含有病原菌情况的检测报告,并探讨了高通量测序技术在今后临床实际应用时进一步提高检测速度和灵敏度的方法。

高通量测序多SNP单体型连锁分析技术诊断罗氏易位患者正常胚胎的临床应用

目的探讨高通量测序多SNP单体型连锁分析技术在诊断罗氏易位患者的正常胚胎中的应用价值。方法对2018~2020年在北部战区总医院生殖医学科就诊的5对罗氏易位夫妇采用高通量测序多SNP单体型连锁分析技术区分罗氏易位携带和正常胚胎。从着丝粒附近3 Mb或5 Mb区域内筛选有效的高频SNP位点作为标记,对父母和易位染色体胚胎非整倍体检测(PGT-A)结果异常的胚胎(作为参照)进行连锁分析,分别构建易位染色体断裂点附近区域(长臂端)的单体型,再利用单体型结果判断PGT-A结果正常胚胎的衍生染色体携带状态(即正常或携带者);移植检测正常的胚胎,并进行产前诊断。结果5对罗氏易位携带者夫妇共有7个促排卵周期,共检测了50个胚胎,其中整倍体胚胎24个。经多SNP单体型连锁分析技术诊断,染色体正常胚胎13个,染色体正常胚胎占整倍体胚胎比例为54.2%(13/24)。实施9个复苏移植周期,移植9个染色体正常胚胎,获得临床妊娠6个周期,分娩4个染色体正常婴儿,另有1例继续妊娠中。结论高通量测序多SNP单体型连锁分析技术可以区分携带或不携带亲代罗氏易位染色体的胚胎,从而可以诊断出染色体正常的胚胎,帮助患者出生染色体正常的婴儿。

利用高通量测序技术发现植物小分子RNA研究进展

小分子RNA是一类长约20～30个核苷酸的非编码RNA分子,其介导的转录后基因调控是植物中的一种新型基因调控机制。它在植物的生长发育和适应外界各种环境胁迫的过程中起着非常重要的作用。植物中小分子RNA数量巨大、种类繁多,而高通量测序技术的出现大大加快了它们的发现过程。本文在简要介绍目前已知植物小分子RNA的类型及特点的基础上,综合阐述近年来利用高通量测序技术克隆和分析植物小分子RNA的研究成果,以期反映当前植物小分子RNA的基因组分布规律、功能和进化等方面的最新研究进展。

基于高通量测序的废次烟末水提液中细菌群落分析

为了解造纸法再造烟叶生产过程中不同烟末提取液的微生物变化,利用Roche 454 FLX焦磷酸高通量测序法,比较废次烟末水提液中细菌16S rRNA基因序列的多样性,获得了废次烟末水提液中细菌种群的组成和丰度的变化。结果表明:在废次烟末水提液的原液(M1)、浓缩液(M2)及醇化液(M3)样品中,细菌种群组成非常丰富,其中占主导地位的细菌种群是厚壁菌门,而厚壁菌门中的优势菌属是乳杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属。从M1到M3的过程中,乳杆菌属丰度呈下降趋势,而赖氨酸芽孢杆菌属丰度呈上升趋势。基于高通量测序的细菌群落变化趋势可为改善造纸法再造烟叶的品质提供依据。

高通量测序技术在临床医学中的应用进展

高通量测序技术(第二代测序技术)近年来取得快速发展,与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点,主要以454测序技术、Solexa测序技术以及SOLiD测序技术为代表。高通量测序技术在生命科学以及医学领域方面的研究越来越广泛,该文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。

基于高通量测序的内蒙古姆州诺尔盐湖细菌群落组成分析

从内蒙古姆州(多罗)诺尔盐湖采集卤水样品,提取总DNA后对其细菌16S rRNA基因进行PCR扩增,通过454高通量测序,得到优化序列9903条,共分入1325个OTU中。优化序列经筛选后得到8320个序列,分别归入细菌13个门,其中变形菌门(Proteobacteria)占主要地位,占总序列数的39.39%;其次32.08%的序列归入拟杆菌门(Bacteroidetes)。在纲水平上,所得序列分别属于Cytophagia,γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria),α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)和浮霉菌纲(Phycisphaerae)。属水平上的数据表明,所得序列属于硝化球菌属(Nitrococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、海杆菌属(Marinobacter)、Gracilimonas、盐厌氧菌属(Halanaerobium)、弧菌属(Salinivibrio)和Salinibacter等。研究揭示了姆州诺尔盐湖嗜盐细菌群落组成,表明姆州诺尔盐湖存在丰富的嗜盐细菌资源和潜在的新类群,从而为新种的挖掘及嗜盐菌的开发提供了理论数据。

第二代高通量测序技术的原理及其在医学中的应用进展

第二代高通量测序技术近年来取得了较快发展,与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点,主要包括454测序技术、Solexa测序技术以及SOLID测序技术。高通量测序技术在医学领域的研究越来越广泛,本文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。

基于聚合酶链式反应-高通量测序(PCR-HTS)联用的cry2A基因鉴定方法

cry2基因对多种鳞翅目害虫具有高毒力,且与cry1A类基因无交互抗性,具有重要的应用价值。为了提高苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)cry2杀虫基因资源的筛选和鉴定效率,本研究分析了所有已报到的cry2A基因的保守区,设计了4对通用引物,对2000株Bt菌株基因组DNA混合样品进行了PCR扩增,并利用454高通量测序仪对这些混合扩增产物进行了测序。测序总量有280704条Reads,序列分析结果表明,这些Bt菌株中含有已知的所有9类cry2类基因,其中包括cry2Ae和cry2Ai这2类在国内Bt菌株中未见报道的基因;同时,发现了新型cry2类基因的片段;随后设计特异性引物,扩增获得了半长基因片段cry2-1和cry2-2,进一步利用重叠PCR法获得了全长新基因cry2X,该基因的编码区为1902 bp,编码633个氨基酸;其氨基酸序列与Cry2Ab13蛋白的相似性最高,为93%,属于第三等级的模式基因。建立聚合酶链式反应-高通量测序(polymerase chain reaction-high throughput sequencing,PCR-HTS)联用的基因鉴定方法,具有快速、灵敏、准确、高通量、覆盖范围广等优点,不仅可以对Bt菌株中已知杀虫基因进行鉴定,而且能够发现新的基因,将在Bt基因鉴定、发掘中发挥重要的作用。

高通量测序技术的研究进展

高通量测序技术又称二代测序技术(NGS),与被认为是第一代测序技术的传统Sanger毛细管电泳测序方法相比,二代测序技术以更低的成本提供更高通量的数据,并实现大规模的基因组研究,单次运行数据量大,可以同时对数百万个DNA分子实施测序。随着当代科学技术的进步,二代测序平台已逐渐被引入包括肿瘤学在内的众多领域中,如临床诊断,农业基因组学和法医学等。尽管NGS目前已广泛用于目的性研究,但由于该方法的新颖性,在临床实践中的应用尚未完全指南式化,大多数临床医生对NGS认知及解读能力参差不齐。该文就NGS方法、原理及其优劣性进行综述,旨在帮助临床医生利用NGS技术对疾病进行更全方位的诊疗提供参考。

高通量测序技术在植物MicroRNA研究中的应用

MicroRNA是一类广泛存在于动植物中长约21 nt的非编码小分子RNA,主要通过内切核苷酸或者翻译抑制调节基因转录后表达。植物MicroRNA在植物的生长发育、开花时序、新陈代谢及环境胁迫等方面起重要作用。简述了植物MicroRNA的生物发生、作用机制及调控功能,并在此基础上综述了高通量测序技术在植物MicroRNA研究中的最新应用进展。

基于454测序的油茶DNA序列微卫星观察与分析

采用MISA软件挖掘比较各1/4个454高通量测序反应获得的普通油茶、浙江红山茶和短柱茶EST序列及普通油茶基因组序列中的微卫星信息。结果显示:3个种的EST序列微卫星出现频率大小相近,普通油茶EST序列的微卫星出现频率高于其基因组序列的;在所有被检索序列的二至六碱基微卫星中,均以二碱基微卫星最多(>55%),并以(AG)n类型为主,但三碱基微卫星在所有EST序列中以(AAG)n类型最多,而在普通油茶基因组序列中则以(AAT)n最多;除六碱基微卫星外,二至五碱基微卫星均表现为不同微卫星重复单元的丰度随着微卫星碱基长度增加而减少。在转录组序列中,除六碱基微卫星之外,不同微卫星单元重复数的变异与重复单元长度呈负相关,推测二碱基微卫星理论多态性最高,而五碱基微卫星理论多态性最低;对在无冗余独立基因各区域中的微卫星进行统计,显示分布比例依次为3'UTR>CDS>5'UTR,在相同区域内比较,UTR区域中二碱基微卫星占总数量比例最大,CDS区域内三碱基微卫星的比例最高,此外5'UTR区域的三碱基微卫星的分布比例均高于3'UTR,初步推断5'UTR区域的微卫星相对3'UTR要保守些。

应用454测序技术分析种植制度对黑垆土微生物多样性的影响

研究典型种植制度对旱地黑垆土微生物多样性的影响,对优化旱地作物种植制度、发挥土壤潜在肥力、实现土壤资源可持续利用有着重要的意义。通过27年长期定位试验,采用454测序技术分析了黄土高原旱作地区不同种植制度下黑垆土细菌、真菌多样性的变化情况。结果表明,不施肥低营养胁迫下,细菌多样性表现为粮豆轮作>小麦连作>裸地>苜蓿连作,真菌多样性表现为小麦连作≈苜蓿连作>裸地>粮豆轮作。施氮、磷肥条件下,粮草长周期轮作(苜蓿→苜蓿→苜蓿→苜蓿→马铃薯→小麦→小麦→小麦+苜蓿)中土壤微生物多样性大致表现出先降低后增加的趋势,第4年苜蓿或苜蓿茬后第1年小麦微生物Chao指数和Shannon指数最低,苜蓿茬后第2年小麦微生物多样性最高,细菌Chao指数和真菌Shannon指数比连作小麦高22.0%和79.2%;粮草短周期轮作(红豆草→小麦→小麦+红豆草)中土壤微生物多样性大致呈现增加趋势,至红豆草茬后第2年小麦土壤微生物多样性达到最高,真菌Chao指数和Shannon指数均分别比连作小麦高50.8%和51.0%。黄土高原旱地区黑垆土采取粮食作物与豆科作物轮作可提高土壤微生物多样性。

454测序技术在微生物生态学研究中的应用

以Sanger法(双脱氧核苷酸末端终止法)为代表的第1代测序技术由于其成本高、速度慢、通量低等不足,满足不了大规模测序的要求。进入21世纪后,以Roche 454为代表的第2代测序技术诞生了,454测序法作为一种高通量的测序方法,近年来已被广泛应用于微生物生态学研究中。介绍了该测序技术的原理和操作步骤,结合本实验室的研究成果,对近年来运用454测序技术在微生物生态学研究中的进展进行综述,并对其研究前景进行介绍。

454测序技术在医学昆虫研究中的应用

医学昆虫是具有医学和经济双重意义的重要媒介生物，严重影响人们生活质量与身体健康。防制技术的进步是基于对其生物学认识（如生态习性、生理特点）的深入，但目前从基因组角度的了解却知之甚少。为此，研究人员采用下一代高通量测序技术从组学角度进行研究，其中454焦磷酸测序技术兼具经济性与读长最长的特点，尤其适合于无参考基因组的非模式医学昆虫应用。本文简介了454测序原理，主要从技术特点、应用范围等角度将其与Solexa测序、基因芯片技术进行比较；综述了近期在医学昆虫领域取得的研究结果，包括抗药性分子机制、虫媒病原体检测、系统发育及分类鉴定、重要生理功能相关转录谱分析等，以期为其在更多媒介生物中的应用提供指导。

Roche 454测序技术

454公司可谓第二代测序技术的奠基者。2005年底,454公司推出了基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System。这一技术开创了边合成边测序（sequencing by synthesis）的先河,被《Nature》杂志以里程碑事件报道。之后,454公司被罗氏诊断公司收购。1年后,他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System（GS FLX）。

海洋沉积物氨氧化菌群落结构的测序分析

本文以氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)特征基因氨单加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)α亚基基因(amoA)为目标基因(～491bp),分别采用克隆文库、454高通量测序和illumina测序技术对其群落结构进行了比较研究。结果表明, 454高通量测序和illumina测序技术得到的菌群多样性及丰富度均高于克隆文库技术。在菌群组成方面,虽然3种测序技术检测到的优势类群均为亚硝化螺菌,但在菌群丰度方面存在差异。3种测序技术中,克隆文库技术在很大程度上可能高估物种丰度,且对部分低丰度类群的检测能力有限;illumina单端测序由于其测序片段较短,可能存在物种注释错误、不能准确区分各物种间序列差异等问题;比较而言, 454高通量测序技术能较为全面和准确地反映海洋沉积物中AOB的菌群结构特征。