基于核苷酸序列的罗非鱼罗湖病毒分子流行病学分析

通过对NCBI数据库里的罗湖病毒(tilapia lake virus,TiLV)核苷酸序列进行生物信息学分析,了解罗湖病毒在全球的流行情况和中国罗非鱼(tilapia)养殖中罗湖病毒的感染情况。该研究将第3个片段的序列比对结果中的罗湖病毒分成12个簇群,通过对片段进行motif序列富集,显示motif序列每个位点的碱基。对从广东各地区罗非鱼养殖场采集到的302份样本进行检测,结果显示,均未检测出罗湖病毒阳性,并且显示motif序列位点的碱基非常稳定。通过对罗湖病毒进行分子流行病学分析,中国虽未有罗湖病毒流行的趋势,但在进出口贸易中仍要严格防控罗湖病毒的输入,并应对这些非常保守的motif的相关功能进行深入研究。

罗湖病毒研究进展

2009年以来,以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发养殖和野生罗非鱼大量死亡事件。直到2014年,才发现其致病病原是新型RNA病毒——罗湖病毒。本文介绍了罗湖病毒的几次流行情况及其临诊症状,包括以色列、厄瓜多尔、埃及等国家发生的罗非鱼大量死亡事件,以及厄瓜多尔养殖罗非鱼死亡事件中的初步病原学研究、罗湖病毒的发现和首次命名、病毒的基因组特征研究、厄瓜多尔死鱼事件的再次研究、埃及罗非鱼检出罗湖病毒阳性等,并结合该病毒的特点提出了防治建议。

罗湖病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。【结果】标准曲线在2.5×10^8~2.5×10^0拷贝数之间有良好的线性关系(相关系数R2=0.999),检测限为2.5×100个拷贝。试验内及试验间变异系数分别为0.11%~0.43%与0.54%~1.13%,重复性强;对水生动物其他病毒和细菌均无扩增反应,有很好的特异性。【结论】新建立的罗湖病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可用于TiLV的早期的快速诊断、流行病学调查和防控。

罗非鱼罗湖病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

近年来,罗湖病毒(Tilapia lake virus,TiLV)频繁出现,给罗非鱼养殖业造成巨大损失。本文建立的罗湖病毒实时荧光反转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术,操作简单,检测灵敏度可达30 copies/反应,特异性良好,对其他常见的淡水鱼类病毒核酸无非特异性扩增。31份样本中,阳性3份,阴性28份,检测结果与RT-PCR方法基本一致,两者的符合率为97%。本文建立的TiLV实时荧光RT-LAMP快速诊断新方法,可及时监控、预警我国罗非鱼养殖过程中罗湖病毒(TiLV)的存在,为全面提升我国罗非鱼养殖技术水平和效益提供技术支持。

罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立快速检测罗非鱼罗湖病毒(Tilapia Lake Virus,Ti LV)的RT-PCR方法。【方法】参照GenBank中罗非鱼罗湖病毒全基因序列,依据其假定蛋白基因片段3设计合成1对特异性扩增引物,提取罗湖病毒RNA,逆转录成cDNA,进行PCR扩增,通过优化扩增条件和扩增体系,建立快速检测罗非鱼罗湖病毒的RT-PCR方法。用该方法对自然感染罗湖病毒发病的罗非鱼样品进行RT-PCR扩增。【结果】RT-PCR扩增得到与试验设计相符的499 bp的特异性目的条带,而对健康罗非鱼、野生罗非鱼及其他病毒对照组的扩增结果均为阴性。测序比对结果表明,该方法检测结果准确,最低可检测出约10fg/mL的质粒DNA,具有较好的特异性和较高的敏感性。用该方法对332份临床样品进行RT-PCR检测,其中36份样品扩增出特异性的目的条带,经测序比对,检测结果正确。【结论】建立的检测方法可用于TiLV的检测。

罗湖病毒RT-LAMP方法的建立与应用

为快速检测罗湖病毒(tilapia lake virus,TiLV),根据TiLV编码RNA聚合酶的片段1,设计了6条特异性引物,通过对反应体系优化,建立了检测TiLV的RT-LAMP方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行了评价。结果显示:该方法特异性好,仅能够对TiLV进行特异性扩增,对真鲷虹彩病毒等10种鱼类常见病毒扩增均呈阴性;灵敏度为2.5×10^(-7) ng/µL,且30 min即可得到试验结果;两组重复试验显示,该方法重复性良好,且熔解曲线相一致。结果表明,成功建立了快速检测TiLV的RT-LAMP方法。本研究为快速诊断、监测TiLV提供了技术支撑。

罗湖病毒(TiLV)RT-qPCR方法的建立

研究根据罗湖病毒(Tilapia lake virus,TiLV)编码RNA聚合酶的基因片段1设计1对特异性引物和探针,建立一种检测TiLV的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法,并对该检测方法进行了反应体系和条件优化。结果表明,优化的20μL反应体系:2×Probe RT-PCR Master Mix 10μL,QN Probe RT-Mix 0.2μL,5μmol/L的引物TiLV-qF、TiLV-qR、探针TiLV-qP各1μL,模板1μL,补充RNase-free water至20μL。优化的反应条件:反转录45℃20 min;预变性95℃5 min;扩增95℃15 s,60℃1 min,40个循环。荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。本文建立的RT-qPCR方法检测TiLV的特异性好,重复性好,灵敏度高,灵敏度为2.5×10^(-8) ng/μL,可为TiLV的监测和预防提供技术支撑。

深圳市罗湖区2003年传染性非典型肺炎流行病学分析

目的 了解 2 0 0 3年深圳市罗湖区传染性非典型肺炎 (SARS)流行病学特点。方法 通过查阅病案资料和访问病愈的患者 ,按统一个案调查表收集病例资料 ,ELISA检测病例恢复期血清SARS冠状病毒抗体。结果 2 0 0 3年 2～ 6月罗湖区各类医疗机构报告SARS观察病例和疑似病例共10 3例 ,其中 15例被诊断为SARS。 3月份发病最多 ,为 8例 ;东门街道报告病例最多为 5例 ;男女性别比为 2∶1,年龄最大的 6 9岁 ,最小的 4岁 ,中位数为 33岁 ;从事商业服务业的最多 ,为 6例。经检测的11例中 9例血清SARS冠状病毒抗体呈阳性。除 1例为续发病例外 ,其余 14例传染源不明确。结论 深圳市罗湖区SARS病例呈社区散发 ,由于预防控制措施及时实施 ,未形成传播链 ,避免了医院疫情暴发和医务人员感染的发生。

“罗湖医改”模式下新冠肺炎社区防控及效果评价

目的探讨"罗湖医改"模式下新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的社区防控开展情况,并进行初步评价。方法采用描述性流行病学方法对深圳市罗湖医院集团社康和罗湖区部分民办社康联合体即康君联合体社康的COVID-19的监测和居家隔离情况进行分析,并通过对比分析深圳市其他区COVID-19的发病传播情况,评价"罗湖医改"模式下罗湖医院集团社康COVID-19的社区防控效果。结果 2020年1月8日—2020年3月2日,罗湖医院集团社康COVID-19监测排查34 625人,康君联合社康监测排查19 317人,相对于各自的服务人口数差异有显著统计学意义(χ~2=440.90,P <0.001);罗湖医院集团社康纳入居家隔离人数为6 077人,康君联合社康纳入居家隔离人数为3 229人,相对于各自的监测排查人数差异有统计学意义(χ~2=6.06,P <0.05)。在纳入居家隔离的及时性上,罗湖医院集团社康居家隔离人群的返深时间与纳入居家隔离时间间隔为(2.31±5.08)d,而康君联合体社康的时间间隔为(5.32±6.29)d,差异有统计学意义(t′=23.42,P <0.05)。罗湖医院集团社康累计居家隔离人数高峰期是2月1日,比康君联合体社康早4 d,比深圳市密切接触者的管理人数高峰期早7 d。同时罗湖区在2020年2月14日—3月2日,COVID-19病例零增长,深圳市其他区还有波动。结论在"罗湖医改"模式下,罗湖医院集团社康的新型冠状病毒肺炎社区防控相对于罗湖区部分民办社康联合体社康即康君联合体社康监测排查更加严格,纳入居家隔离更加及时,同时COVID-19的发病情况相对于深圳市其他区更早实现零增长。