广东罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及生物学特性分析

本研究旨在明确当前罗非鱼无乳链球菌流行状况和生物学特性,为鱼源无乳链球菌病防控提供新的数据。本研究于2019—2020年,从广东罗非鱼主养区茂名、湛江地区采集病样进行无乳链球菌的分离鉴定。用PCR方法对分离株血清型及4个主要毒力基因进行检测,通过纸片法对分离菌株进行31种抗菌药物药敏试验和多重耐药研究,利用斑马鱼模型进行了致病性试验。结果显示:从261份病样中分离到35株无乳链球菌;血清型检测表明无乳链球菌分离株的血清型均为Ia型;主要毒力基因的检测证明,cylE、sodA、gapC基因在所有鱼源分离株及人源、牛源和鱼源参考株中检出率均为100%,而scpB只在人源参考菌株中检出;药敏试验结果发现,无乳链球菌分离株对19种抗菌药敏感率为90%以上,对6种抗菌药耐药率为50%以上,分离株的耐药基因型和表型部分一致,无乳链球菌分离株均多重耐药,其中5重及以上耐药的菌株为27株,占总菌株数的77.1%;斑马鱼致病试验表明,无乳链球菌分离株可导致斑马鱼不同程度的发病死亡。本研究明确了当前罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因、耐药特性和致病性,为广东乃至全国罗非鱼无乳链球菌病的防控提供了参考。

外源物质对低盐罗非鱼糜蛋白构象及体外消化特性的影响

以微波超声波辅助制备的低盐罗非鱼糜凝胶为研究对象,分析谷氨酰胺转氨酶(TGase)、羟丙基二淀粉磷酸酯(HDP)、结冷胶和三者的复配物(THG)对其水分分布及蛋白质构象的影响;并通过体外模拟消化实验,探究不同外源物质对微波超声波辅助制备的低盐罗非鱼鱼糕体外消化特性的影响。结果表明:添加THG后,鱼糜结合水和不易流动水较空白组分别增加98.71%和14.75%,自由水含量显著减少(P<0.05);THG促进了α-螺旋向β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构转化。与空白组相比,添加0.4%TGase和THG对低盐罗非鱼糕的胃排空速度、蛋白体外消化率及蛋白水解度均有正面作用;其中THG可显著促进蛋白质分解成粒径较小的聚集体(P<0.05),经胃-十二指肠消化结束后的消化产物颜色更加透明清晰,从激光共聚焦显微镜可观察到THG组的红色荧光亮点显著减少,反映其蛋白被消化得较为完全。由此可见,在THG的作用下,鱼糜中水分子与蛋白质结合更紧密,相对于单一的外源物质,THG更加明显地改变了蛋白质的构象,且更有利于疏水蛋白基团的暴露和蛋白间的相互作用,且对鱼糕的消化有促进作用。本研究的结果为罗非鱼糜凝胶特性研究及罗非鱼糕类食品的开发与应用提供理论参考。

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

罗非鱼混养对广西三江传统稻渔综合种养系统环境及其菌群多样性的影响

研究罗非鱼混养对广西三江传统稻渔综合种养系统环境的影响,可为科学推广稻田金边鲤-罗非鱼混养模式提供基础。2021年5-10月设置3个试验组和1个对照组研究不同密度混养对种养系统环境及菌群多样性的影响,其中试验组内进行罗非鱼和金边鲤的混养,对照组为鲤单养组。结果表明,金边鲤的生长未受到罗非鱼混养的影响;高通量测序结果显示水体中的主要菌群为变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria),其次为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和蓝菌门(Cyanobacteria),主要功能为化能异养和有氧化能异养;底泥中的主要菌群为变形菌门和绿弯菌门(Chloroflexi),其次为酸杆菌门(Acidobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)和蓝菌门,主要功能类群为甲烷生成和化能异养。罗非鱼高密度混养组稻田底泥中的总氮和硝酸盐氮含量有所下降,水体中Polynucleobacter等水质良好的指示物种相对丰度增加,罗非鱼混养对稻渔综合种养系统环境及其菌群产生了有益的影响。

罗非鱼养殖尾水絮凝去除效果研究

罗非鱼养殖尾水中含有大量的残饲和粪便等颗粒悬浮物,这些物质是氮、磷营养元素的主要载体。将养殖尾水外排会导致周边水体富营养化。当前常见的尾水处理方式具有占地面积大、投资高、效率低等缺点,影响其推广使用。为解决这一问题,探索采用絮凝工艺对罗非鱼养殖尾水进行处理,选取聚合硫酸铁、三氯化铁、壳聚糖和碳酸镁等4种絮凝剂,通过比较浊度、总悬浮物和化学需氧量的去除效果,筛选出适合用于养殖尾水处理的絮凝剂。结果显示:聚合硫酸铁的效果优于其他3种絮凝剂。在投加量0.4 g/L、pH=8、絮凝时间15 min时,聚合硫酸铁对养殖尾水的浊度、总悬浮固体颗粒物(TSS)和化学需氧量(COD)的去除率分别达到了96.7%、92.6%和95.1%。对絮凝后絮体评价发现,絮体的沉降高度与浊度去除率具有一定相关性,絮体的成长受成核作用的影响。尾水处理前后的zeta电位说明聚合硫酸铁通过破坏尾水中的悬浮物的稳定结构而净化尾水。研究表明,在罗非鱼养殖尾水处理时,可选择聚合硫酸铁作为絮凝剂。

POU1F1基因SNP位点与尼罗罗非鱼体质量和形态性状的相关性

【目的】研究POU1F1基因的单核苷酸多态性(SNP),评估多态性与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的体质量和形态性状的相关性,为罗非鱼以生长性状为目的的选育提供参考。【方法】利用PCR产物测序方法,从POU1F1中共筛查到28个多态性较高的位点,分析尼罗罗非鱼高要亲代群体的这些位点与其体质量及全长、体长、头长、体高、体宽等6个形态性状的相关性,并在尼罗罗非鱼高要子代群体和番禺群体中验证,将获得的体质量和形态相关位点进一步在尼罗罗非鱼海南群体中验证。【结果与结论】高要亲代群体和子代群体中,分别有6个位点[S3(A-400G)、S4(A-469T)、S5(I-539D)、S6(A-881G)、S7(A-888G)和S12(C-1365T)]和5个位点[S3、S5、S11(I-1358D)、S13(C-1511T)、S14(A-1539T)]与体质量、形态性状相关。POU1F1基因11个SNP位点中,未发现与番禺群体体质量和形态性状相关联的位点。POU1F1基因6个SNP位点与海南雌雄群体关联分析表明,S4位点与海南雌性群体体质量相关,S3和S5位点与雄性群体体质量相关。双倍型与各群体体质量、各形态性状关联分析表明,在高要亲代群体中获得体宽相关双倍型2个;在高要子代群体、番禺群体及海南雄性群体中未获得与生长性状相关双倍型;在海南雌性群体中获得与体质量相关的双倍型1个。

即食调味罗非鱼块制备工艺研究

[目的]以新鲜罗非鱼为原料制备即食罗非鱼块产品。[方法]通过单因素及正交试验以成品感官品质为评价指标对即食调味罗非鱼块的腌制去腥、调味处理、高温烘制等加工工艺进行研究。[结果]最佳工艺为:食盐4%、白酒3%、姜12%、蒜12%、葱12%腌制30分钟,食盐3%、花椒粉3%、辣椒粉6%调味30分钟,在65℃条件下烘制2h取出冷却后放冰箱冷藏24小时,65℃下复烘1h,最后刷油在160℃条件下烘烤10min。[结论]按此工艺生产的即食调味罗非鱼鱼块具有咸淡适中、肉质软硬恰当、味道鲜香麻辣的口感。

罗非鱼AT2-R抑制罗非鱼湖病毒复制的初步研究

为研究罗非鱼血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2-R)在罗非鱼湖病毒(TiLV)感染过程中的功能,通过RT-PCR技术克隆得到体质量(20±5)g罗非鱼AT2-R(OnAT2-R)基因完整的开放阅读框序列,并运用qRT-PCR分析OnAT2-R基因的组织分布及时相表达,同时构建重组真核表达载体pEYFPOnAT2-R,在罗非鱼脑细胞中进行亚细胞定位分析,最后通过罗非鱼脑细胞过表达OnAT2-R基因后感染罗非鱼湖病毒,利用qRT-PCR方法检测TiLV-S8片段的相对表达量。试验结果显示,OnAT2-R基因开放阅读框序列全长1338bp,编码445个氨基酸,具有1个7次跨膜区域。在罗非鱼被检测的各个组织中,OnAT2-R基因均有分布,肝脏的表达量最高,其次是肌肉和皮肤,脾脏和胃的表达量最低。健康罗非鱼感染罗非鱼湖病毒后,OnAT2-R基因在肝脏中的表达量先增后减,在肌肉中的表达量先增后减再增。成功构建了pEYFP-OnAT2-R,亚细胞定位结果显示OnAT2-R主要定位于细胞膜上。在罗非鱼脑细胞中过表达OnAT2-R基因后感染罗非鱼湖病毒,发现TiLV-S8节段的mRNA水平显著降低。试验结果表明,OnAT2-R是一个潜在的定位于细胞膜且具有抑制罗非鱼湖病毒复制作用的细胞表面分子受体,这为后续深入研究罗非鱼湖病毒感染机理及罗非鱼抗病毒机制提供理论参考。

罗非鱼皮胶原酶抑制肽的制备、体外活性及其理化特性研究

罗非鱼皮富含胶原蛋白,是一种制备生物活性肽的理想原料。以罗非鱼皮为原料,采用酶解法制备罗非鱼皮胶原酶抑制肽(Tilapia skin collagenase inhibitory peptide,TSCIP),并对其胶原酶抑制活性与金属离子结合活性的相关性进行研究,以期为罗非鱼加工副产物的高值化利用与食物蛋白源胶原酶抑制剂的研发提供参考。结果表明,罗非鱼皮经碱性蛋白酶酶解4 h后的产物具有最高的胶原酶抑制活性和锌离子(Zn^(2+))、镁离子(Mg^(2+))结合活性,并探明其主要由小分子肽(<1000 D占85.65%)组成。紫外、傅里叶变换红外光谱以及圆二色谱分析显示,TSCIP与Zn^(2+)、Mg^(2+)以及胶原酶结合后其二级结构发生了变化,β-折叠含量明显增加;Zn^(2+)、Mg^(2+)主要通过羧基氧、氨基氮原子以及羰基与TS-CIP结合,胶原酶主要通过氨基氮原子以及羰基与TSCIP结合。

挂浆对罗非鱼片预制菜品质提升及蛋白质稳定性的影响

以罗非鱼(Oreochromis mossambicus)鱼片为原料的酸菜鱼产品是水产类预制菜的主要品种之一。为提升鱼片在复热时的质构稳定性,探讨了挂浆对鱼片品质和鱼肉蛋白稳定性的影响。通过添加淀粉、蛋清粉、花生油降低鱼片在复热过程中的蒸煮损失率,提升鱼片的质构特性,优化3类物质的添加量和工艺,以解决鱼片类预制菜在复热过程中易破碎的问题。结果表明,添加淀粉、蛋清粉和花生油均能抑制罗非鱼片的水分流失,降低蒸煮损失,提升质构特性,同时对汤汁浑浊度的影响较小。提高罗非鱼片煮制品质稳定性的最佳挂浆工艺为:淀粉添加量4.4%、蛋清粉添加量3.6%、花生油添加量1.4%、腌制时间13 min。鱼片在此条件下的综合得分(16.16±0.53)接近于预测值(16.70),说明工艺稳定可靠。与未挂浆鱼片相比,优化条件下鱼片煮制的质构硬度提高了74.2%,汤汁浑浊度降低了42.7%,蛋白质的α-螺旋和β-转角结构相对含量更多,结构更稳定,肌纤维间连接的紧密性更好,食用品质显著提升。

5种氧化型减菌剂对罗非鱼片品质及蛋白质的影响

本研究以罗非鱼片为原料,考察5种常见氧化型减菌剂(H_(2)O_(2)溶液、ClO_(2)溶液、NaClO溶液、臭氧水和微酸性电解水)的减菌效果及其对鱼片质构特性、色泽及肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)氧化情况的影响。结果表明,减菌率达80%时各氧化型减菌剂的质量浓度和作用时间分别为:1500 mg/L H_(2)O_(2)溶液浸泡8 min;200 mg/L ClO_(2)溶液浸泡10 min;200 mg/L NaClO溶液浸泡10 min;9 mg/L臭氧水浸泡10 min;30 mg/L微酸性电解水浸泡20 min。在上述5种减菌条件下对鱼肉色泽、质构特性、MP氧化情况与对照组进行比较,发现减菌处理后的罗非鱼片硬度、L*值增大,a*值减小,MP质量浓度、总巯基含量下降,羰基含量升高,表面疏水性基团数量增加,其中微酸性电解水和NaClO溶液处理组蛋白质的变性程度最明显;蛋白荧光强度降低,其中微酸性电解水处理组降低幅度最大;MP的α-螺旋和β-转角相对含量降低,β-折叠和无规卷曲相对含量增加,其中微酸性电解水处理组蛋白质二级结构变化最显著(P<0.05);MP发生不同程度的降解,微酸性电解水处理组降解程度高于其他处理组。综上所述,氧化型减菌处理后鱼肉MP发生不同程度的氧化,其中微酸性电解水处理对蛋白质的氧化作用最强。

植物乳植杆菌通过抑制蛋白水解改善罗非鱼发酵鱼糜凝胶强度

利用微生物发酵能有效改善淡水鱼鱼糜的凝胶强度。罗非鱼鱼糜的凝胶强度低且在加工过程中易出现凝胶劣化。为开发高品质的罗非鱼发酵鱼糜制品,以植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)为发酵菌株,探究了加菌发酵对罗非鱼发酵鱼糜凝胶强度的影响。结果表明,加菌发酵能够显著改善罗非鱼发酵鱼糜的凝胶强度,降低大部分游离氨基酸以及总氨基酸的含量。采用16S rRNA高通量测序技术研究加菌发酵对罗非鱼发酵鱼糜中微生物菌群的影响,结果显示,加菌发酵鱼糜中乳植杆菌属一直为优势菌属,到发酵末期增至63.71%,而其他腐败微生物菌属的丰度显著下降,同时菌落总数明显低于自然发酵鱼糜。构建了不同发酵时期的相关性网络图,结果表明在整个发酵期凝胶强度与菌落总数和总氨基酸含量呈显著负相关,仅乳植杆菌属与菌落总数和总氨基酸含量呈显著负相关,而与凝胶强度呈显著正相关。研究表明,植物乳植杆菌可以通过抑制腐败微生物的生长以及对蛋白质的水解作用来改善罗非鱼发酵鱼糜的凝胶强度。植物乳植杆菌可以作为专用发酵剂开发高品质罗非鱼鱼糜发酵制品。

ATP含量与外源酶添加对罗非鱼肌原纤维蛋白磷酸化水平的影响

蛋白质磷酸化修饰可影响肌肉品质,为探究外源酶添加对罗非鱼肌原纤维蛋白蛋白质磷酸化水平的影响,在向罗非鱼肌原纤维蛋白溶液中分别加入蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)后进行体外孵育,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光染色测定不同时间段内的磷酸化水平变化。并通过将罗非鱼肌肉浸泡在不同浓度ATP溶液中测定肌原纤维蛋白的蛋白磷酸化水平以探究ATP对其的影响。结果显示,在0~72 h,PKA组磷酸化水平均显著高于对照组和AP组,PKA组整体磷酸化水平从0 h的0.35±0.01上升至12 h的0.37±0.01,而后下降至72 h的0.29±0.01,呈先上升后下降的趋势,其中,肌球蛋白重链磷酸化水平和肌动蛋白磷酸化水平分别从0 h的0.73±0.01、0.86±0.01下降至72 h的0.58±0.02和0.68±0.01。当孵育时间为0、4、24和48 h时,3组磷酸化水平均具有显著差异。在外源添加0.3 mol/L ATP后,结果显示肌原纤维蛋白整体磷酸化水平(0.46±0.00)显著高于对照组(0.42±0.01)。PKA可促进罗非鱼肌原纤维蛋白磷酸化修饰,AP则使其去磷酸化。研究表明,宰杀后罗非鱼肌肉中的ATP含量、PKA及AP活性水平是影响蛋白质磷酸化水平的关键因素。本研究可为探明罗非鱼品质变化机制与调控策略提供理论依据。

两个奥利亚罗非鱼品系对无乳链球菌的耐受性研究

为探讨两个奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)品系对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的耐受性,研究以奥利亚罗非鱼埃及品系(AE品系)和“夏奥1号”(AX品系)为研究对象,人工腹腔注射无乳链球菌,并在感染后0、7h、24h、48h、72h、120h和168h采集罗非鱼血液和脾脏,比较感染后7d存活率差异,研究血清生化指标和脾脏促炎性细胞因子表达变化。结果显示,人工感染后AE奥利亚罗非鱼存活率显著高于AX奥利亚罗非鱼。感染后两种奥利亚罗非鱼血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、球蛋白(GLO)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和溶菌酶(LZM)含量在感染后都显著升高;甘油三酯(TG)和白蛋白/球蛋白(A/G)显著下降,呼吸暴发受抑制;且AE品系的血清GLO和SOD水平在感染后期显著高于AX品系。定量PCR结果显示两种奥利亚罗非鱼脾脏TNF-α、IL-1β和IL-6表达在感染后7h都显著升高,但AE品系在感染后期3种促炎性细胞因子的表达都显著低于AX品系。研究表明,AE品系对无乳链球菌的抗病力强于AX品系,在感染后期的抗氧化能力更强,炎症程度更轻,从而保持对无乳链球菌更大的耐受性。研究结果为培育抗链球菌病的奥尼罗非鱼提供抗性的亲本种质资源。

罗非鱼链球菌检测方法研究进展

罗非鱼链球菌在世界范围内广泛分布,是威胁全球水产养殖业的重要病原体之一。无乳链球菌(Sreptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Sreptococcus iniae)是引起罗非鱼链球菌病的主要病原体,严重危害罗非鱼养殖业的健康发展。适合应用场景的快速、准确无乳链球菌和海豚链球菌检测技术,对于预防罗非鱼链球菌病的大规模暴发十分必要。本文总结了近年来罗非鱼链球菌检测方法研究状况,包括细菌分离培养鉴定、免疫学方法和分子生物学检测方法等,以期为罗非鱼链球菌病的诊断和预防提供技术支撑。

罗非鱼戴维斯黄杆菌实时定量PCR检测方法的建立及应用

戴维斯黄杆菌(Flavobacterium davisii)是柱形病病原之一,严重影响罗非鱼养殖产业.为了实现对其快速和准确的诊断,本研究以TonB基因为靶基因构建了重组质粒,建立了戴维斯黄杆菌的实时定量PCR检测方法,并将其应用到罗非鱼感染戴维斯黄杆菌后的载菌量测定研究.结果表明:特异性引物TonB-F/R与不同基因型的黄杆菌及罗非鱼其他常见病原无交叉反应,所建立的绝对定量检测方法是常规PCR检测方法灵敏度的100倍,其重复性和稳定性良好;罗非鱼感染戴维斯黄杆菌后其鳃组织载菌量显著高于其他组织,符合该疾病的侵染特点.综上所述,该实时定量PCR检测方法具有快速、高灵敏度和强特异性等优势,可准确评估戴维斯黄杆菌的感染程度,对柱形病的预防具有重要价值.

表面活化附着纳米银的聚醚砜抗菌膜的制备以及其在罗非鱼保鲜中的应用

水产品在贮藏过程中,细菌侵染导致的腐烂变质是一个备受关注的问题。为此,该研究致力于开发一种新型抗菌包装来提高罗非鱼的保鲜效果。通过用浓硫酸将聚醚砜(polyethersulfone,PES)材料磺化并将其作为膜基质。傅里叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)、热重法(thermal analysis,TG)和接触角(contact angle,CA)分析结果表明,磺化改性后提高了材料的亲水性和表面活性。在此基础上,将银纳米颗粒(silver nanoparticles,AgNPs)嵌合到膜材料中合成磺化聚醚砜-银纳米颗粒(sulfonated polyethersulfone-silver nanoparticles,SPES-AgNPs)抗菌膜。用扫描电子显微镜、原子力电子显微镜及X射线等方法分析该抑菌膜的表征,通过Ag^(+)释放实验测定其安全范围,并采用抗菌环实验测定该膜的抗菌性能。结果表明,磺化改性后的SPES材料与AgNPs结合良好,AgNPs在膜上平均尺寸约为10~100 nm。Ag^(+)释放实验显示,SPES-AgNPs膜的Ag^(+)释放量始终保持在安全范围内。SPES-AgNPs膜可以有效抑制铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、李斯特菌及大肠杆菌,其平均抑制率达到85%以上。将SPES-AgNPs膜用于罗非鱼的保鲜,所有样品在(1±0.1)℃的冷冻箱贮存18 d,通过定期对菌落总数、厌氧菌落总数、嗜冷菌落总数、总挥发性盐基氮值以及k值进行测定,并以感官评分为基础对罗非鱼样品新鲜度进行分析。结果表明,该膜能够延缓鱼肉样品保存时在化学、微生物和感官等方面的变化,可以提高罗非鱼的贮存品质并延长其保质期,是具有广阔应用前景的水产品包装材料。

饥饿胁迫下罗非鱼下丘脑转录组研究

有鉴于鱼类摄食调控具明显种属差异性,为解析吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)食欲调控机制,本研究采用RNA-Seq测序技术,通过对罗非鱼禁饲3 d和6 d以模拟长短期饥饿胁迫压力,针对其下丘脑组织进行转录组分析.发现饥饿胁迫下多个基因差异表达,针对这些基因的聚类分析、KEGG分析、GO分析以及蛋白互作分析支持罗非鱼黑皮质素系统参与罗非鱼下丘脑食欲的核心调控,此外,多个下丘脑核心调控因子包括食欲肽,促生长激素神经肽等在饥饿胁迫下差异表达,共同参与罗非鱼摄食调控.以上分析结果初步解析了罗非鱼饥饿胁迫下下丘脑差异基因表达图谱.

罗非鱼优势耐冰温假单胞菌的分离鉴定及耐冰温基因

【目的】分析罗非鱼(Oreochromis mossambicus)中优势耐冰温假单胞菌(Pseudomonas)特有的基因特征和耐冰温基因。【方法】采用全长16S rDNA测序找出冰温贮藏罗非鱼中的优势假单胞菌,进行分离、鉴定;通过Illumina平台对其进行基因组从头测序,并通过基因家族分析确定耐冰温假单胞菌的核心基因家族,再与不耐冰温的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)的基因组比较,筛选出耐冰温假单胞菌特有的核心基因家族;结合文献报道的假单胞菌的寒冷适应基因筛查出耐冰温假单胞菌潜在的耐冰温基因。【结果与结论】发现并分离出冰温贮藏罗非鱼中丰度最高的5株腐败菌,经鉴定均为布氏假单胞菌(Pseudomonas bubulae)和莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)。这5株假单胞菌的核心基因家族有3 692个,其中861个在不耐冰温的铜绿假单胞菌的基因组中不存在,此861个特有的核心基因家族在群体感应、类固醇的降解、某些氨基酸和肽的代谢、脂肪酸降解、抗坏血酸和醛糖酸代谢、柠檬烯和蒎烯降解、丁酸代谢、苯乙烯降解和香叶醇降解等途径中显著富集。进一步筛查发现上述5株耐冰温假单胞菌带有不耐冰温的铜绿假单胞菌没有的des、cbpM、ousA、treP、treR、trxC和grX等基因。

尼罗罗非鱼claudin-5基因克隆及其在无乳链球菌胁迫下的表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)紧密连接蛋白5(claudin-5)基因,分析其在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)刺激下的表达模式,为进一步了解该基因功能提供依据。【方法】根据NCBI已公布的尼罗罗非鱼基因组预测序列(GenBank登录号:XM_005473513.4),选取其claudin-5基因的CDS区,设计claudin-5基因的克隆及实时荧光定量PCR引物。利用生物信息学对克隆得到的claudin-5进行理化性质和进化分析,采用qRT-PCR分析尼罗罗非鱼claudin-5在各组织中及无乳链球菌刺激下的表达模式。【结果】通过PCR克隆技术获得尼罗罗非鱼claudin-5基因全长序列,共651 bp,编码216个氨基酸;蛋白分子量约23 kD,理论等电点(pI)为8.53;具有4个跨膜结构域和3个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点。尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼(O.aurea)的claudin-5氨基酸序列相似性高达97.55%;系统发育进化树结果也显示,二者claudin-5氨基酸序列聚为一支,表明二者具有较近的亲缘关系。尼罗罗非鱼claudin-5在脑部的表达量极高,是血细胞等组织的300倍左右,具有明显的组织特异性。经无乳链球菌刺激后,尼罗罗非鱼脑和头肾的claudin-5表达量在12 h时达到最高值,在24 h时有所下调,其中在脑部的表达量于48 h表达量最低,但仍高于0 h,而在头肾的表达量在48~96 h时出现明显上调后下降;肠中claudin-5表达量在无乳链球菌刺激后6~12 h时上升缓慢,在48 h时表达量大幅度上调,并达到最高值,之后在48~96 h时出现下调,但低于0 h;肝脏中claudin-5表达量在无乳链球菌刺激后出现明显下调,在24 h略有回升然后继续下调。【结论】尼罗罗非鱼claudin-5基因在脑组织的表达量极高,具有明显的组织特异性,其编码蛋白在宿主抵抗无乳链球菌入侵的过程中发挥重要作用,尤其是通过血脑屏障抵抗无乳链球菌,保护中枢神经系统。