改良的环介导等温扩增技术在羊布鲁菌病快速诊断中的应用

布鲁菌病严重威胁人类健康和畜牧业生产的常见人畜共患病。建立改良的LAMP,对防控布鲁菌病的传播具有重要意义。选择羊布鲁菌标准菌株DNA保守序列,设计LAMP引物;建立并优化LAMP快速检测体系;通过倍比稀释法等完成灵敏度和特异性实验;选择可疑布鲁菌感染羊血液样本200例,分别进行LAMP、PCR和RBPT检测,完成一致性检验。LAMP反应体系中MgSO_(4)为8 mmol/L,甜菜碱为0.8 mmol/L,钙黄绿素为5 mmol/L,MnCl_(2)为10 mmol/L;布鲁菌均呈现绿色,5种阴性菌株均为橙色;随着模板稀释度的逐渐增大,扩增开始时间逐渐延长,检测极限为10 copies/μL,与凝胶电泳、PCR结果一致;与PCR比较,羊血液标本LAMP阳性率基本一致,无统计学意义(P>0.05);与RBPT比较,LAMP阳性率显著升高,有统计学意义(P<0.05);PCR和LAMP检测一致性较好(Kappa=0.987,P>0.7)。因此,本研究为布鲁菌病提供了特异性好,灵敏度高检测试剂盒。

羊布鲁菌外膜蛋白Bp-26基因的克隆及其原核表达

应用PCR扩增羊布鲁菌M5-90株基因组DNA,得到大小为753bp的Bp-26基因,将其克隆入pMD20-T载体上,测序正确后,构建重组质粒pET-28a-Bp-26,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导其表达,用Western blot鉴定蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a-Bp-26原核表达载体,并在E.coli BL21中表达Bp-26基因,为开展羊布鲁菌Bp-26目的蛋白的抗原性分析和功能研究奠定了基础。

羊布鲁菌O链M抗原提纯及其单克隆抗体的研制

目的研制羊布鲁菌O链M纯化抗原及其单克隆抗体。方法采用冷酚法提纯羊布鲁菌16M的O链抗原,并经琼脂糖凝胶免疫扩散和SDS-PAGE鉴定,用灭活的该抗原免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并进行鉴定。结果建立3株分泌单克隆抗体的细胞株2D10、3C6和1E10,ELISA效价分别为1.380、1.109和1.048,与大肠杆菌0:157、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、鼠伤寒沙门菌和猪胸膜肺炎放线杆菌均无交叉反应。3C6和1E10与牛布鲁菌544A发生交叉反应,2D10的亲和常数达5.30×10~7M^(-1)。结论已制备出纯化的羊布鲁菌O链M抗原及其单抗。

羊布鲁菌外膜蛋白Omp22的原核表达及鉴定

布鲁菌外膜蛋白Omp22与布鲁菌致病性相关,又可诱导机体免疫反应。为进一步研究Omp22的特性,对其进行原核表达,并初步鉴定。根据Genbank序列,设计并合成羊布鲁菌外膜蛋白Omp22引物。以羊布鲁菌M5株基因组DAN为模板,PCR扩增并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。酶切鉴定正确后,测定序列;将重组质粒pGEX-4T-1-Omp22电转化大肠杆菌DH5α中,诱导表达,并采用羊布鲁菌兔免疫血清,Western-blot初步检测融合蛋白GST-Omp22表达情况和免疫学特性。结果PCR扩增出约660bp目的条带,与预期相符;酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-Omp22原核表达载体;优化诱导温度,结果表明,在25℃诱导表达时,该融合蛋白大部分出现在上清中;Western-blot结果证实,GST-Omp22可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。说明成功构建了Omp22蛋白原核表达载体并进行了可溶性表达;该融合蛋白可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。Omp22蛋白的表达,为进一步研究布鲁菌的致病机制以及疫苗研制奠定基础。

羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d的原核表达、鉴定及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d基因的克隆,原核表达,以及纯化,根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白Omp25d蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为650bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-Omp25d。在大肠杆菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定GST-Omp25d蛋白。结果成功地构建了pGEX-4T-1-Omp25d原核表达载体并在大肠杆菌中表达了Omp25d基因,纯化后所获得的融合蛋白与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应。表明研究成功构建了pGEX-4T-1-Omp25d元和表达载体,并且在大肠杆菌中进行表达,纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。

羊布鲁菌外膜蛋白omp2b的克隆,原核表达及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白omp2b基因的克隆,原核表达,以及纯化。根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白omp2b蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为1 130 bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-omp2b。在大肠埃希菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定纯化蛋白。结果成功构建了pGEX-4T-1-omp2b原核表达载体并在大肠埃希菌中表达了omp2b基因,纯化后所获得的蛋白与目的蛋白大小一致且与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应,说明其为布鲁菌omp2b蛋白。本研究成功构建了pGEX-4T-1-omp2b原核表达载体,并且在大肠埃希菌中进行表达,纯化的omp2b蛋白具有良好的免疫原性。

羊布鲁菌外膜蛋白31诱导不同时间对小胶质细胞自噬的影响

目的确定羊布鲁菌外膜蛋白31(Omp31)引起小胶质细胞(BV-2细胞)明显自噬的时间,为进一步研究自噬与炎症的关系提供实验依据。方法用0.5μg·mL^(-1)的Omp31分别处理BV-2细胞0、6、12和24 h,收集细胞和上清液;采用透射电镜技术观察各组细胞自噬体;用RT-qPCR技术检测LC3B mRNA的表达;用Western blot法检测兔抗小鼠微管相关蛋白轻链3B(LC3B)Ⅱ蛋白的表达;ELISA法分别检测上清液中TNF-α、IL-6和IL^(-1)0的表达量。结果 0.5μg·m L^(-1) Omp31处理细胞6 h能形成较多自噬体,促进LC3B mRNA表达,且能明显增加LC3BⅡ蛋白的表达量;而处理细胞12、24 h则抑制LC3B mRNA表达;0.5μg·m L^(-1) Omp31能诱导BV-2细胞表达TNF-α、IL-6,且具有时间依赖性,但对IL^(-1)0的表达有抑制作用。结论 0.5μg·m L^(-1)Omp31处理BV-2细胞6 h能诱导小胶质细胞发生明显自噬。

襄阳市人感染羊布鲁菌1例

布鲁菌病是由布鲁杆菌引起的一种人畜共患传染病，包括羊种菌、牛种菌、猪种菌、森林鼠种菌、绵羊副睾种菌、犬种菌6个生物种，我国羊种菌占绝对优势。布鲁菌病在我国为国家法定乙类传染病。布鲁菌病流行广泛，具有明显的地区性。

羊布鲁菌BCSP31蛋白表达纯化及其单克隆抗体的制备

目的:表达并纯化羊布鲁菌BCSP31蛋白,制备其单克隆抗体(mAb).方法:采用GST亲和层析纯化的方法纯化BCSP31蛋白.用纯化的BCSP31蛋白免疫小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,ELISA间接法筛选阳性克隆,3次克隆化后建立杂交瘤细胞系.采用小鼠腹腔接种杂交瘤细胞制备腹水,正辛酸-硫酸铵法纯化mAb.采用Western Blot和ELISA等方法鉴定mAb特性.结果:GST-BCSP31融合蛋白在25℃诱导时为可溶性表达,经亲和层析纯化,获得BCSP31纯化蛋白0.5 g/L;Western Blot检测结果显示所获蛋白可与兔抗布鲁菌阳性血清特异性反应.获得2株mAb,分别命名为1F1,1E5.结论:BCSP31蛋白的纯化及其mAb的制备为布鲁菌病的诊断与防治奠定了一定的物质基础.

抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体制备及初步鉴定

制备抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体(mAb),为进一步研制布鲁菌检测方法和免疫制剂提供基础。常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗核糖体蛋白L7/L12的mAb,并用Westernblot和ELISA方法对其特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。获得了4株抗L7/L12蛋白的mAb:1B1,2A2,2H9和2H10,相对亲和力为2A2>2H10>2H9>1B1,4株mAb识别的抗原表位相近,但仍存在一定的差异。得到的4株稳定的杂交瘤细胞系分泌的mAb能特异结合L7/L12蛋白。

28种中药提取物对羊布鲁菌体外抑菌活性研究

目的研究中药提取物对羊布鲁菌的抗菌活性,为临床羊布鲁菌感染患者选用中药治疗提供实验依据。方法使用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪及16S rDNA基因序列分析对临床分离的羊布鲁菌进行菌种鉴定;采用微量肉汤稀释法测定紫草、虎杖及钩藤等28种中药提取物对羊布鲁菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。结果VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪及16S rDNA基因序列分析的细菌鉴定结果均为羊布鲁菌(Brucella melitensis)。28种中药提取物中,紫草、虎杖、钩藤对羊布鲁菌的MIC为15. 6 mg/m L;女贞子、山豆根、连翘、黄精、白芍的MIC为31. 25 mg/m L;黄药子、玄参、厚朴、益母草、瓜菱的MIC为62. 5 mg/m L;龙胆草、菌味、百部、木香的MIC为125 mg/m L;苦瓜、天冬、杜仲的MIC为250 mg/m L;猪牙皂、拳参、三七、木蝴蝶、姜黄、白芨的MIC为500 mg/m L;半夏、黄柏的MIC> 1000 mg/m L。结论 28种中药提取物中,除半夏和黄柏外对羊布鲁菌都具有一定程度的抗菌作用,以紫草、虎杖和钩藤对羊布鲁菌的抗菌效果最好,女贞子、山豆根、连翘、黄精、白芍次之。因此,临床治疗羊布鲁菌感染患者,可选用抗菌效果较好的中药辅助治疗,减少抗菌药物长时间使用,避免药物的耐药性及毒副作用的产生。

血培养中羊布鲁菌的检出

布鲁菌属为革兰阴性球杆菌，此菌寄生宿主非常广泛，猫、羊、牛、猪是人类布鲁菌的重要传染源，以皮肤接触感染为主，表现为反复波浪型热，笔者所在科室于2007—2008年血培养中检出3例羊布鲁菌，由于笔者所在科室第1次检出此菌，颇费周折，此次经验对于基层医院有值得鉴戒之处，现报告如下。

羊布鲁菌病的病因分析及防控措施

布鲁菌病是目前世界上最常见的一种人畜共患传染病,分布广泛,一年四季均可发生,危害性非常严重,常可引起人和动物生殖器官及胎膜发炎,发生流产、不孕及各种组织局部坏死,严重影响着人们的健康和养殖业的快速发展。结合多年临床经验,就羊布鲁菌的发病原因、临床症状、病理变化及防控措施等方面进行阐述,以期提高人们对羊布鲁菌的防控意识。

羊布鲁菌病的诊断与防治

羊布鲁菌病是国家规定强制免疫的高危病种,为了加强群众和行业人员对其认识,具体分析了该病的严重危害性及其流行特点和临床症状,结合细菌学、血清学试验的科学方法,提供了正确的诊断技术及常用防治方法。

羊布鲁菌杆病的防控措施

羊布鲁菌杆病(Brucellosis)是能够致使人畜共患病的一种烈性传染病,羊布鲁菌杆病也属于现阶段造成全球危害最大的一种人畜共患病。该病的传播不但能给养殖业的经营造成致命的经济亏损,更会给养殖户的生命安全造成直接重大威胁。因此,结合现今的临床病例,对羊布鲁菌杆病发病诱因以及临床特征进行深入分析,并且制定出行之有效的防控检疫措施,是当前预防羊布鲁菌杆病的重要防控工作。

羊布鲁菌潜在疫苗靶标的蛋白质组学分析

持续存在的抗生素耐药性风险正在成为影响公众健康的全球性问题。因此,迫切需要设计针对致病性细菌的新疗法。羊布鲁菌是布鲁菌病的病原体,主要感染绵羊和山羊,感染牛、水牛、牦牛和狗的病例也有报道。受感染的动物也是人类羊布鲁菌感染的主要来源。动物疾病控制和根除以及人类感染预防的当务之急是开发更安全、有效的布鲁菌疫苗。该研究采用计算机技术,设计了一种针对羊布鲁菌的电子多表位疫苗。

羊布鲁菌强毒株16M与疫苗株M5外膜蛋白蛋白质组学研究

通过比较蛋白质组学分析M5生存表型的改变所引起的蛋白图谱与强毒株的差异之处,根据这些差异表达蛋白的LC/MS-MS鉴定结果来分析疫苗株的致弱机制进而为寻找新的毒力相关分子、鉴别诊断分子以及揭示布鲁菌胞内寄生机制提供帮助。本研究利用比较蛋白质组学技术,对布鲁菌强毒株16 M和弱毒株M5的外膜蛋白进行了差异比较分析,结果共发现33个差异蛋白点,代表了26个开放阅读框,这些蛋白涉及了蛋白质的生物合成(5/26)、氨基酸合成(3/26),脂肪酸代谢(2/26)、能量代谢(5/26),以及细胞被膜生物合成(4/26)和一些调节系统(4/26)等多个生物过程。这些发现为研究外膜蛋白在布鲁菌毒力,胞内寄生等过程中发挥的重要作用提供了新依据。

羊布鲁菌16MUGPase基因缺失株的构建及其特性分析

目的构建羊布鲁菌16M株的尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶(UTP-glucose-1-phosphate-uridylyltransferase,简称UGPase)基因缺失候选疫苗株,并对其侵染宿主巨噬细胞的能力及毒力进行初步分析。方法采用PCR技术对羊布鲁菌的UGPase基因上、下游同源臂进行克隆,利用基因同源重组技术构建自杀质粒,经两步筛选法对重组菌株筛选后,进行巨噬细胞黏附侵袭试验和小鼠体内毒力试验。结果自杀质粒p BK-CMV-Sac B-△UGP构建成功,经双向筛选获得了羊布鲁菌UGPase基因缺失株16M△UGP。16M△UGP缺失株侵入巨噬细胞的CFU数低于16M强毒株,但高于M5疫苗株;小鼠攻毒14 d后,其平均脾指数为(6.55±0.27)g,平均克脾菌数为1.64×104CFU/g,均低于16M强毒株。结论成功构建了羊布鲁菌16M株的UGPase基因缺失株,并证实了UGPase基因的缺失对16M株毒力具有一定影响。

羊布鲁菌16M Omp25真核表达载体的构建

利用聚合酶链式反应(PCR),以羊布鲁菌16M基因组为模板克隆Omp25基因,设计含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物序列,定向克隆到真核表达载体pCMV-HA上,构建真核表达重组质粒pCMV-HA-Omp25。经测序及双酶切验证正确,证明成功构建了pCMV-HA-Omp25真核表达质粒,为表达纯化外膜蛋白Omp25,研究其功能奠定基础。