羊接触传染性脓疱皮炎病毒PCR检测方法建立及初步应用

以Gen Bank上羊接触传染性脓疱皮炎病毒(ORFV)B2L基因序列,用Primer premier 5.0软件设计1对引物并合成,经PCR条件优化,确定了最佳的PCR反应条件,建立了羊接触传染性脓疱皮炎病毒PCR检测方法。结果显示,设计的引物能扩增出的PCR产物为540bp左右,与预期大小一致;同时检测山羊痘病毒,结果均为阴性;该方法能检出羊接触传染性脓疱皮炎病毒最低量为5pg。经证实,建立起羊接触传染性脓疱皮炎病毒PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于临床病料检测。

羊接触传染性脓疱性皮炎病毒核酸及蛋白类型分析

对从中国不同地区采集的１１株羊接触传染性脓疱性皮炎病毒（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｅｃｔｈｙｍａｖｉｒｕｓ，ＣＥＶ；ｏｒｆｖｉｒｕｓ）的痂块毒ＤＮＡ进行提取，用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｐａⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＫｐｎⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳，确定了各毒株的核酸及分子量。结果表明，各毒株的核酸酶切片段在８～１５个之间，病毒基因组大小有１０～２５ｋｂ的差异。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析了经ＮＰ－４０和２－巯基乙醇裂解蔗糖密度梯度离心纯化的各病毒株的囊膜蛋白，结果显示，各毒株可分离出１８～３３个不同的蛋白区带，毒株间的差异主要集中在３６４００～８００００区带之间。结合２次交互免疫试验结果，将以上１１株羊接触传染性脓疱性皮炎病毒分为４大类。

应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了 1对引物 ,建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明 ,PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析 ,与已报道NZ 2株的核苷酸序列同源性高达 97%。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒 ,结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的。

光敏生物素标记IgG检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒囊膜蛋白及重组表达蛋白

用光敏生物素标记从兔抗羊接触传染性脓疱性皮炎病毒超免疫血清中提取纯化的IgG ,把从蔗糖密度梯度离心纯化的病毒用 2 ME和NP4 0裂解后与重组转化菌 pGRL 4A和pGRH 3A一起进行SDS PAGE ,并进行转移电泳。对用光敏生物素标记的IgG进行Western blot ting印迹杂交检测。结果 ,检测到产生IgG的病毒囊膜蛋白有 5条 ,分子量分别为 12 5 .0、96 .0、83.0、5 6 .3和 4 2 .0ku ;检测到重组菌 pGRL 4A和 pGRH 3A可表达分泌其中的 3条囊膜蛋白 ,其分子量分别为 83.0、5 6 .3和 4 2 .0ku ;pGRL 4A的表达较强 ,对 4 2 .0ku蛋白的分泌量最高。所重组的病毒DNAHindⅢ

羊传染性脓疱病毒口唇和内脏感染株趋化因子结合蛋白基因差异分析及原核表达

[目的]克隆羊传染性脓疱病毒(ORFV)口唇和内脏感染株趋化因子结合蛋白(CBP)基因并进行生物信息学分析及原核表达,为后续研究CBP基因在ORFV免疫逃逸机制中的作用提供基础数据。[方法]以患病羔羊口唇结痂和小肠提取的DNA为模板设计特异性引物,进行PCR扩增并克隆测序,对表达的CBP基因遗传进化关系及蛋白理化性质、结构特点进行分析;利用原核表达系统pGEX-4T-1构建重组质粒pGEX-4T-1-CBP-K、pGEX-4T-1-CBP-N并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,并通过Western blotting对蛋白进行抗原性分析。[结果]经测序,ORFV口唇感染株CBP基因全长873 bp,内脏感染株CBP基因全长846 bp,且后者在第217 bp处有24 bp碱基的丢失。系统进化树显示,口唇与内脏感染株不属于同一进化分支,遗传距离较远;口唇感染株CBP基因与中国吉林分离株亲缘关系最近;内脏感染株CBP基因与马来西亚分离株亲缘关系最近。口唇感染株CBP基因编码291个氨基酸,内脏感染株CBP基因编码282个氨基酸,蛋白二级结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构有5处差异,主要是α-螺旋和β-折叠的变化。试验成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N,其在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中以包涵体形式表达CBP融合蛋白,分子质量约为60 ku。[结论]本研究内脏感染株与口唇感染株相比,存在24 bp的缺失,并成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N,可在大肠杆菌中表达CBP融合蛋白。本研究结果为揭示CBP在ORFV与宿主互作中发挥的作用提供参考,也可为寻找新的羊传染性脓疱防治方法提供依据。

羊传染性脓疱皮炎病毒的细胞培养

在确定内蒙古白音锡勒牧场羊传染性脓疱皮炎的基础上,我们利用犊牛睾丸细胞培养白音锡勒牧场传染性脓疱皮炎病毒(Orf virus)获得成功,现将培养方法介绍如下。

接触传染性脓疱皮炎病毒B2L基因的克隆和序列分析

参照文献和 Gen Bank发表的接触传染性脓疱皮炎病毒 (CPDV ) NZ- 2株的 Bam H / B片段的基因序列 ,设计并合成 1对引物 ,通过 PCR扩增出国内 CPDV疫苗株和 3个分离株的 B2 L 基因 ,目的片段长约 1.13kb。将目的片段克隆到 p MD18- T载体后进行序列测定 ,并用 DNAStar软件比较分析国内的 CPDV株与 NZ- 2株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果表明 ,国内疫苗株和 3株分离株的核苷酸序列同源性分别为 99.7%、96 .9%和 97.4 % ,与国外 NZ- 2株的同源性为 96 .1%。国内 CPDV株与 NZ- 2株的氨基酸序列同源性分别为 92 .0 %～ 96 .0 % ,表明CPDV Bam H / B2 L基因变异的幅度小。

一例人感染羊接触传染性脓疱皮炎的确诊

2013年6月6日,云南省江川县动物疫病预防与控制中心的一名兽医在保定可疑羊接触传染性脓疱皮炎发病羊时不慎被羊咬伤手指,10 d后在伤口愈合处形成丘疹,随后发展为水疱,最后形成结痂。随着痂皮的逐渐脱落,直至丘疹出现后1个多月感染病灶才完全愈合。经过对发病羊口唇痂垢及人手指丘疹、水疱液样品进行PCR、Real-time PCR及序列比对分析,2份样品均扩增出1225 bp的预期大小片段,Real-time PCR也扩增出标准S形曲线和Rn指数增长峰,2份病料测定出的序列(1133 bp)完全一致,与NCBI GenBank中的羊口疮病毒参考毒株NC-005336.1(1133/1133)对应序列的相似性达到100%,与AY386264.1(1115/1133)、AY386263.1(1114/1133)、HM133903.1(1113/1133)、KF837136.1(1110/1133)及普洱毒株PUER/YN/CHIA/2011(1113/1133)对应序列相似性达到98%,与DQ184476.1(1104/1133)对应序列相似性达到97%,与NCBI GenBank中同为副痘病毒属成员的伪牛痘参考毒株GQ329669.1(1052/1140)、GQ329670.1(1051/1140)对应序列的相似性达到92%,与牛丘疹性口炎病毒参考毒株AY386265.1(905/1130)的对应序列的相似性仅达到80%。由此,确诊此次病例为人感染羊传染性脓疱病毒。

羊传染性脓疱病毒和支原体混合感染的诊治

羊传染性脓疱病毒和支原体是两种常见的羊病原体,它们可以单独引起疾病,也可混合感染,导致更为复杂和严重的临床症状。本文综述了羊传染性脓疱病毒和支原体混感的诊治要点,包括病原学、流行病学、临床表现、诊断方法、治疗措施以及预防控制策略。

羊传染性脓疱皮炎病毒弱毒株的培育研究

羊传染性脓疱皮炎(Contagious Pustulaz dermatitis)是羊的一种急性病毒性传染病,在全国养羊区普遍流行,危害严重。1980年开始,我们首先确定了病原,并在犊牛睾丸细胞上培养成功。在此基础上,对毒力强、免疫原性好的HCE毒株通过犊牛睾丸细胞连续继代,毒力出现不同程度的减弱。

羊传染性脓疱病毒的发生、诊断与防控

羊传染性脓疱病毒病又名羊口疮,是由羊传染性脓疱病毒引发的一种急性、高度接触性的传染性疾病。羊传染性脓疱病毒病在我国羊养殖区内广泛存在,具有传染性强、传播迅速、反复发生等特征,羊群一旦出现感病后难以根除,严重影响羊养殖经济效益。目前,羊传染性脓疱病毒病尚未有特效治疗方法及特效药物,做好该病的防控管理十分关键。本文对羊传染性脓疱病毒的发生、诊断及防控进行分析,以期能够为羊疾病防控提供建议。

羊接触传染性脓疱性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒试验

为保证羊接触传染性脓疱性皮炎弱毒疫苗的质量,检测成品疫苗的免疫保护率,进行了羊接触传染性脓疱性皮炎弱毒疫苗的免疫攻毒试验。先用羊接触传染性脓疱性皮炎弱毒疫苗免疫实验动物,然后用强毒攻击实验动物。结果表明:成品疫苗均达到了相关标准。

羊传染性脓疱的防治技术

羊传染性脓疱又称传染性脓疱性皮炎、羊口疮,是羊感染传染性脓疱病毒引起的一种急性、接触性的人畜共患传染性疾病。该病发病率高,所有品种、不同性别、不同年龄的羊均可感染,特别是对羔羊的危害极为严重。笔者就羊传染性脓疱的流行特征、临床症状和治疗方法等进行阐述,并提出有效的预防措施,为广大养殖户提供参考。

羊传染性脓疱病毒湖北株的鉴定及分子特征分析

为了确诊疑似羊传染性脓疱病例,分析羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV)的分子特征,作者以湖北某羊场疑似传染性脓疱病料为对象,进行了电镜观察、病理切片染色、特异性目的基因扩增和序列测定及遗传进化关系分析。结果在电镜下观察到ORFV样粒子,切片HE染色可见有炎性细胞浸润,自病料中扩增出特异性目的ORFVB2L基因片段(GenBank序列号GU320351)。结果表明该病例为黑山羊传染性脓疱病毒引起,序列遗传进化分析表明该病毒和2007年分离于中国台湾的毒株(DQ904351)遗传关系最近,和印度2004到2005年分离于绵羊(DQ263306、DQ263305)、山羊(DQ263304、DQ263303)的ORFV同属于一个进化分支。本研究为ORFV分子流行病学研究积累了资料。

羊传染性脓疱病毒基因组结构和主要基因功能研究进展

羊传染性脓疱(羊口疮)是由羊传染性脓疱病毒(羊口疮病毒,ORFV)引起的一种重要人兽共患传染病,ORFV作为副痘病毒属的代表成员之一,其基因组结构和功能具有明显的种属特异性。ORFV基因组是由中央核心区和两端反向末端重复序列构成,中央核心区主要调控病毒的复制、组装和释放,两端重复序列则决定ORFV的毒力、宿主范围、参与免疫逃避及免疫调节。论文综述了ORFV的基因组结构及功能最新研究进展。

羊传染性脓疱病毒的分离鉴定

为了对羊传染性脓疱病毒的分离株ORF027基因、ORF059部分基因进行克隆、序列分析以及构建系统进化树,本研究应用犊牛睾丸细胞从病羊痂皮病料中分离获得了1株羊传染性脓疱病毒,命名为Orf-ys,在电镜下观察到了典型的病毒粒子。应用PCR方法扩增获得了2条基因片段,PCR产物克隆至pMD18-T载体,鉴定后测序。序列分析结果表明Orf-ys的2个基因分别与参考毒株的相关基因核苷酸同源性高达97.6%～98.6%和96.9%～98.4%。基因进化树比较显示,与美国OV-IA82株和意大利OV/C2、OV/mi-90株的进化关系最近。

羊传染性脓疱病毒抗干扰素基因(VIR)研究进展

羊传染性脓疱病毒（ORFV）是痘病毒科副痘病毒属的成员之一,引起严重的人兽共患传染病。该病毒基因组全长约134~139kb,编码130多个蛋白,抗干扰素基因是ORFV编码的具有拮抗宿主干扰素功能的蛋白,在ORFV突破宿主免疫屏障过程中有重要作用。本文就抗干扰素基因的研究进展作一综述。

羊传染性脓疱病毒ORF047基因表达及其蛋白在细胞中的定位分析

目的克隆羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)ORF047基因,并进行真核表达及亚细胞定位,为筛选与其相互作用的蛋白提供依据。方法提取羊传染性脓疱病毒分离株的DNA,以其为模板,参照OV-SA00毒株(NC-005336.1)基因ORF047序列,采用PCR技术扩增ORFV ORF047基因片段,凝胶回收后将其插入pEGFP-N1载体,构建重组质粒pEGFPORF047,测序后重组质粒共转染293T细胞,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。后将重组质粒pEGFP-ORF047与pHcRed1-Nuc、pHCRed1-mito、pHcRed1-ER分别共转染Vero-E6细胞,通过激光共聚焦显微镜对融合蛋白进行亚细胞定位分析。结果 ORFV ORF047基因片段大小为735bp;重组质粒pEGFP-ORF047能够在293T细胞中明显表达融合有目的分子的绿色荧光蛋白,Western blotting检测表达的融合蛋白大小约54kD;亚细胞定位分析表明,ORF047蛋白主要定位于胞浆中,少量在线粒体中。结论成功分析了ORF047基因的表达与其蛋白在亚细胞定位。

羊传染性脓疱炎病毒的免疫特性

羊传染性脓疱皮炎(Co-ntagious Ecthyma,CE)是由病毒引起的一种世界性的传染病,除羊易感外,鹿、麝牛、驼、牧犬也感染发病,而且人也感染。我国部分省区有CE爆发和流行的报道。由于该病原具有一定的特殊性,所以本病的诊断与免疫仍未取得突破性进展。(一)CE病毒具有高度嗜上皮性 CE病毒属痘病毒科副痘病毒属,具有高度的嗜上皮性,病毒通过损伤的皮肤和上皮感染,主要感染幼羔,病毒的入侵途径主要是嘴唇、足端、生殖器的皮肤和粘膜。幼羔皮肤娇嫩,容易擦伤,皮肤的损伤及出牙均造成病毒易吸附于这些部位的上皮细胞中,病毒在这些地方的上皮中繁殖,引起增生、变性(空泡化),膨大性变性,产生胞浆内包涵体和液化。