唑类耐药白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶基因的研究

目的探讨白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)基因突变与对唑类抗真菌药物耐药的关系,从分子水平了解其耐药机制。方法纸片扩散法和NCCL公布的M-27方案测定耐药株对氟康唑和伊曲康唑的MIC;设计引物,PCR扩增唑类耐药白色念珠菌的CYP51基因;扩增产物测序并与Genbank序列相比较分析。结果扩增产物测序分析表明,成功扩增到白色念珠菌CYP51基因。与X13296株序列相比较,两个耐药株都存在有意义突变和无意义突变。两株菌共有22个碱基突变。与以往报道的相同,突变发生氨基酸替换的有F105L、K128T、Y133H、T199I、R267H、G464S和G467K。其中,两株菌都有Y132H和G467K突变。F71L、W244R、T311N和T352I为新发现的突变,未见报道。同时,也发现了9个未发生氨基酸替换的突变。结论白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药与CYP51基因突变有关,且为多位点突变。

甲基转移酶样蛋白14对急性早幼粒白血病细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调节作用

目的 探讨过表达和敲低甲基转移酶样蛋白14(METTL14)对急性早幼粒白血病细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调节作用。方法 取人急性早幼粒白血病细胞NB4进行培养,分为过表达对照组、过表达组、干扰对照组、干扰组,过表达对照组及过表达组分别转染空白质粒和METTL14质粒,干扰对照组和干扰组分别转染si-NC和si-METTL14质粒。采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力,Dot Blotting法检测细胞N-6甲基腺苷(m6A)修饰水平。结果 与过表达对照组相比,过表达组细胞增殖率升高、细胞凋亡率降低、细胞迁移数、细胞侵袭数升高,NB4细胞m6A修饰水平提高(P均<0.05);与干扰对照组相比,干扰组细胞增殖率降低、细胞凋亡率增加、细胞迁移数、细胞侵袭数降低,NB4细胞m6A修饰水平降低(P均<0.05)。结论 METTL14可促进NB4细胞增殖、迁移、侵袭,其机制可能与提高m6A修饰水平有关。

抗真菌药物作用靶酶羊毛甾醇14α去甲基化酶研究

羊毛甾醇１４α去甲基化酶是普遍存在于高等植物、真菌和哺乳动物体内的Ｐ４５０蛋白，是氮唑类抗真菌药物作用靶酶．到目前为止已分别确定了高等植物、真菌和哺乳动物体内该酶的氨基酸序列．该酶对底物的催化包括三个单加氧步骤，涉及自由基的生成和消除，血红素辅基在酶催化过程中起重要作用．底物羊毛甾醇只能结合在酶活性位点血红素辅基Ｎｃ吡咯环上方，其余血红素吡咯环被氨基酸残基封闭．底物羊毛甾醇的３β羟基、Δ８（９）双键和１７位侧链是与酶活性位点正确结合的关键官能团．

烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶的三维同源结构建模及其分子对接研究

探究烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶活性位点的结构特征.首次采用同源建模的方法构建了烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶的三维结构,并通过Ramachandran和Profile-3D图验证了模型的可靠性.然后,利用已知的共结晶配体结构,准确定位了14α-去甲基化酶的活性位点,让伏立康唑与靶点进行对接.通过柔性分子对接方法首次阐明了14α-去甲基化酶抑制剂与靶酶活性位点的相互作用模式,明确了14α-去甲基化酶与该类抑制剂结合时起重要作用的氨基酸残基.本研究为基于烟曲霉14α-去甲基化酶三维结构的药物靶点设计提供重要的参考信息,同时也为抗真菌药的发展奠定坚实的理论基础.

甾醇14α-脱甲基酶CYP51蛋白结构及其抗药性功能研究进展

禾谷镰孢菌(Fusarium gra minearum)是引起小麦赤霉病的主要病原真菌,其细胞色素P450甾醇14α-脱甲基酶(CYP51)是唑类杀菌剂作用的主要靶标蛋白。本文在简要介绍小麦赤霉病在中国发生危害与防控现状的基础上,重点探讨了甾醇14α-脱甲基酶的结构及功能、病原真菌对唑类杀菌剂的抗药性研究现状和抗药性治理研究进展,以期对小麦赤霉病的高效防治、减少或延缓抗药性的发生以及对抗药性的治理提供新的思路。

基于真菌14α-去甲基化酶的非氮唑类抗真菌先导化合物的设计、合成及其体外抗真菌活性研究

基于真菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)活性位点的三维结构设计并合成了新型四氢异喹啉类抗真菌先导化合物.体外抗真菌活性研究显示:设计的先导化合物具有较好的抗真菌活性.其中化合物5f和5g对于5种测试菌的抗真菌活性强于或相当于对照药物氟康唑.先导分子通过与靶酶活性腔氨基酸残基的非共价键结合产生抗真菌作用,避免与血红素辅基Fe原子发生配位结合,为一类具有新作用机理的非氮唑类抗真菌先导化合物.本研究为抗真菌药物研究提供了新的结合方式及结构类型.

棉花中一个钝叶醇14α-脱甲基酶基因同源基因(GhCYP51G1)的克隆、序列特征和表达分析

为研究植物固醇在棉花纤维细胞生长发育中的作用和信号传导机制,通过筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合和分析,从陆地棉栽培品种徐州142正在发育的纤维中克隆了植物固醇合成途径的重要酶基因——钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因,命名为GhCYP51G1(GenBank登录号为EU727154)。该基因编码486个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为55.2kD和8.87。推导的氨基酸序列与烟草、马铃薯和葡萄等物种中CYP51家族成员有较高的同源性。而且具有钝叶醇14α-脱甲基酶序列中的典型保守结构域,如多个底物结合位点和血红素结合域。说明该克隆基因是钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因。实时定量RT-PCR的结果表明GhCYP51G1基因在快速伸长期的纤维中具有较高的表达水平,而在子叶、雌蕊和雄蕊以及开花后6d胚珠、开花后0d和2d的胚珠纤维中表达水平较低。在开花后8d的纤维细胞中GhCYP51G1的表达水平最高,这些结果说明该基因在纤维细胞的伸长生长中具有重要作用。同时在纤维生长过程中,由于生长素能够下调GhCYP51G1基因的表达,暗示植物固醇在植物激素,特别是油菜素类固醇物质和生长素的相互作用中具有一定作用。

禾谷镰刀菌甾醇14α脱甲基酶基因cDNA克隆及生物信息学分析

克隆获得禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)2个甾醇14α脱甲基酶CYP51蛋白(CYP51A、CYP51B)基因c DNA序列,明确其氨基酸序列典型特征,为研究蛋白质结构及其抗药性机制奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆2个CYP51蛋白基因c DNA序列,利用相关生物信息软件对其序列进行生物信息学分析。结果克隆到2条c DNA序列,长度分别为1 524、1 581 bp,分别编码507、526个氨基酸;2个蛋白分子量分别为57.5、59.3 ku,等电点分别为6.93、7.08,不稳定系数分别为49.43、39.05;2个蛋白均含有细胞色素P450家族成员典型的保守结构域;不具有信号肽的属于非分泌性蛋白,具有跨膜结构域,是亲水性蛋白;蛋白质二级结构最主要的结构元件是α螺旋、无规则卷曲,并散布于整个蛋白中;亚细胞定位预测显示,CYP51A蛋白主要位于内质网及高尔基体等细胞器中,而CYP51B主要位于细胞质中。研究结果将为进一步研究CYP51蛋白生物学功能及其蛋白结构生物学提供参考。

羊毛甾醇脱甲基酶变化导致假丝酵母耐药的分子生物学研究进展

假丝酵母是临床常见的条件致病菌 ,抗生素的滥用及放化疗和免疫抑制剂广泛使用 ,使得假丝酵母的感染机会增加 ,针对常见的吡咯类抗真菌药的耐药现象逐年增加。其耐药途径较多 ,包括细胞膜对药物的通透性下降 ,药物在细胞内降解 ,甾醇合成路径的改变 ,细胞膜的排出泵作用增强 ,甾醇合成酶的性质变化等。与假丝酵母耐药性相关的细胞色素 P- 45 0羊毛甾醇脱甲基酶的基因存在 4种改变 :(1)点突变 ;(2 )基因过度表达 ;(3)基因扩增 ;(4 )基因转换或有丝分裂重组 ,导致靶酶的生物学特性变化 ,及其与假丝酵母耐药性的相互关系。表明假丝酵母编码靶酶的基因的变化可导致靶酶一级结构改变和空间构象变化 ,影响药物对靶酶的亲和性 ,或导致靶酶量的变化 ,影响药物的作用 ,产生耐药性。

3—位含氮官能团取代的羊毛甾醇衍生物—甾醇24—甲基化转移酶抑制剂的合成

本文报道了羊毛甾醇3－酮，3－乙酰基羊毛甾醇，3－肟羊毛甾醇，3α－氨基羊毛甾醇和3β－氨基羊毛甾醇的合成方法，所合成的产物应用薄层色谱（Rf值），气相色谱（RRTc值）和光谱学（红外，质谱，核磁共振氢谱和碳谱）等方法鉴定了它们的结构。

水稻C24-甾醇甲基转移酶基因OsSMT2的生物信息学分析

【目的】为水稻C-24甾醇甲基转移酶基因OsSMT2的进一步研究提供理论参考。【方法】以水稻OsSMT2基因为研究对象,通过生物信息学分析方法,对OsSMT2蛋白质的理化性质、结构特点、共表达基因的富集、启动子的顺式作用元件及表达模式等进行分析。【结果】水稻OsSMT2基因CDS全长1092 bp,编码1个含363个氨基酸的蛋白质,该蛋白质具有甲基转移酶结构域和甾醇甲基转移酶C末端结构域;OsSMT2蛋白质不含信号肽,存在1个跨膜结构域;OsSMT2基因的共表达基因主要富集到DNA的复制过程和次生代谢物的生物合成等途径中,可能参与植物的抗寒和抗旱过程;OsSMT2基因在萌发种子中的表达量最高,在叶片的表达量最低。【结论】水稻OsSMT2基因主要在萌发的种子、胚根、胚芽中高表达,参与水稻DNA复制和细胞分裂的主要过程,可作为水稻抗寒和抗旱育种的候选基因。

温胆汤对肥胖代谢相关基因B4 galt7、Sc5d启动子甲基化及表达的影响

目的 分析中医化痰名方温胆汤对肥胖腹腔脂肪组织代谢相关基因B4 galt7、Sc5d启动子区甲基化及表达的影响。方法 首先采用高脂饲料喂养构建肥胖大鼠模型,通过高、中、低不同剂量温胆汤干预肥胖大鼠,观察药物减重降脂的效应;然后采用Massarray技术检测B4Galt7、Sc5d基因启动子甲基化情况;再分别利用实时荧光定量RT-PCR技术、蛋白质印迹技术检测B4Galt7、Sc5d基因的表达情况,分析启动子区甲基化情况与表达间的关系。结果 (1)温胆汤的干预效果与药物浓度无明显剂量依赖关系,高、中剂量温胆汤对肥胖大鼠具有较好减轻体质量作用;温胆汤对改善肥胖大鼠的血脂中TG、TC、LDL-C水平有积极意义,尤其以高剂量组明显。(2)B4 galt7基因启动子区共检测到有31个位点发生甲基化改变。空白对照组与正常对照组比较平均甲基化程度上升,其中有24个位点甲基化程度上升。在此24个位点中,各药物组基本呈现与空白组相对的调控方向,即甲基化程度较空白对照组下降;Sc5d基因启动子区共检测到有37个位点发生甲基化改变。空白对照组与正常对照组比较平均甲基化程度下降,其中有20个位点甲基化程度下降。在此20个位点中,各药物组基本呈现与空白对照组相对的调控方向,即甲基化程度较空白对照组上升。(3)空白对照组与正常对照组相比B4Galt7 mRNA表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05);温胆汤干预后,各药物组表达低于空白对照组,但组间均无统计学差异(P>0.05);空白对照组与正常对照组相比Sc5d mRNA表达增高,差异具有统计学意义(P<0.05);温胆汤干预后,各药物组与空白对照组比较表达降低,其中药物中剂量组降低明显,具有统计学差异(P<0.05)。(4)空白对照组与正常对照组比较,B4Galt7、Sc5d蛋白表达升高明显(P<0.01)。温胆汤干预后,各药物组B4Galt7、Sc5d蛋白表达明显低于空白对照组,且差异存在统计学意义(P<0.01)。结论 温胆汤对B4Galt7基因启动子甲基化程度的影响均与其表达无明显关系,而对Sc5d基因启动子的甲基化的影响与其表达有相关性。

西方蜜蜂m 6A甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式

【目的】本研究旨在克隆西方蜜蜂Apis mellifera RNA m 6A甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)基因AmMETTL14,分析AmMETTL14的理化性质和分子特性以及AmMETTL14在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式,并制备AmMETTL14多克隆抗体,为持续深入开展AmMETTL14的功能研究提供参考和基础。【方法】通过PCR扩增西方蜜蜂AmMETTL14的CDS并进行Sanger测序验证。使用相关生物信息学软件对AmMETTL14进行生物信息学分析,并构建系统进化树。通过原核表达系统诱导表达AmMETTL14融合蛋白,免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blot分别检测抗体的效价及特异性。采用RT-qPCR检测AmMETTL14在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮7种组织中的相对表达量。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmMETTL14的CDS;AmMETTL14的分子式为C 1957 H 3113 N 567 O 589 S 15,分子量约为44.49 kD,脂溶系数为79.97,理论等电点为8.58,平均亲水系数为-0.59,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质;西方蜜蜂、中华蜜蜂A.cerana cerana、黑大蜜蜂A.laboriosa、东方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.dorsata、小蜜蜂A.florea、欧洲熊蜂Bombus terrestris、金环胡蜂Vespa mandarinia、美洲东部熊蜂B.impatiens和黑腹果蝇Drosophila melanogaster的METTL14均含有MT-A70结构域和3个相同的保守基序;AmMETTL14与黑大蜜蜂的METTL14的氨基酸序列一致性最高(65.60%)且亲缘关系最近。制备的AmMETTL14多克隆抗体效价较高(大于512 K)且特异性较强。AmMETTL14在7和8日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在3日龄幼虫中的表达量,在12日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量,在6,12和15日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于1日龄工蜂成虫体内的表达量;AmMETTL14在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量。【结论】研究结果表明,AmMETTL14可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白,AmMETTL14在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用,制备得到的AmMETTL14的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强,为进一步探究AmMETTL14的功能及其参与的表观调控机制打下了基础。

脂多糖诱导人和小鼠肠上皮细胞炎症并上调细胞甲基转移酶样蛋白3(METTL3)和METTL14表达

目的探讨N_(6)-甲基腺苷(m^(6)A)修饰在HIEC-6人肠上皮细胞与MODE-K小鼠肠上皮细胞炎性状态下的变化。方法采用不同剂量的脂多糖(LPS)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激HIEC-6细胞与MODE-K细胞10 h或相同剂量LPS、IL-1β、IL-6、TNF-α分别刺激HIEC-6细胞与MODE-K细胞(0、3、6、12、24)h。实时定量PCR检测细胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达;实时定量PCR和Western blot法分别检测m^(6)A修饰相关分子甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、METTL14、METTL16、Wilms瘤1相关蛋白(WTAP)、烷基化修复同源蛋白5(ALKBH5)、脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)、YTH结构域蛋白1(YTHDC1)、YTHDC2的mRNA和蛋白表达。结果与对照组相比,HIEC-6细胞与MODE-K细胞在LPS诱导的时间依赖与剂量依赖模型中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平增高,并同步上调METTL3和METTL14 mRNA与蛋白水平。结论LPS可以诱导肠上皮细胞出现炎症反应,并上调肠上皮细胞中METTL3和METTL14的表达。

N6-甲基腺苷RNA甲基化修饰在肾纤维化中的研究进展

N6-甲基腺苷(m6A)是真核细胞最丰富的转录后修饰类型。多种类型的RNA,如信使RNA(mRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)、微小RNA(miRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)等,均可发生m6A甲基化修饰。近期研究发现,异常m6A甲基化修饰是肾脏疾病中肾纤维化的“导火索”,可通过不同的靶点、信号通路等对肾间质纤维化产生促进或抑制作用,但具体机制仍需进一步研究。本文对m6A甲基化修饰在肾纤维化中的研究进展进行综述,旨在为临床新药研发提供新思路。

血根碱通过上调m^(6)A甲基转移酶14对胃癌细胞增殖和侵袭的抑制作用

目的·探讨血根碱(sanguinarine,SAG)对胃癌细胞MGC-803和AGS增殖和侵袭的影响,及其作用机制与N6-甲基腺嘌呤(m^(6)A)甲基转移酶(methyltransferase 14,METTL14)的关系。方法·利用不同浓度SAG(0、10、20μmol/L)处理胃癌细胞系MGC-803和AGS,48 h后通过定量PCR和Western blotting检测SAG对METTL14表达的影响。然后用METTL14的小干扰RNA(si-METTL14)慢病毒载体或其空载对照si-NC慢病毒载体转染上述2个胃癌细胞系,再以10μmol/L SAG或PBS处理48 h,将细胞分为si-METTL14+SAG组、si-NC+SAG组和si-NC+PBS组。定量PCR和Western blotting验证si-METTL14转染后METTL14在胃癌细胞的表达水平。噻唑蓝(MTT)细胞增殖实验、细胞克隆形成实验及Transwell侵袭实验分别观察3组细胞的增殖水平、克隆形成数量及侵袭潜能。2组数据间比较采用独立样本t检验,2组以上数据间比较采用单因素方差分析。结果·与对照组(0μmol/L)比较,10μmol/L、20μmol/L SAG在2种胃癌细胞中均可上调METTL14的mRNA和蛋白表达水平(均P<0.05),且呈一定的浓度依赖性。定量PCR和Western blotting结果证实,转染si-METTL14后METTL14在胃癌细胞的表达水平显著降低。MTT细胞增殖实验结果显示,si-NC+SAG组较si-NC+PBS组细胞增殖率显著降低(均P=0.000);克隆形成实验结果显示,si-NC+SAG组较si-NC+PBS组细胞克隆数显著减少(均P<0.01);Transwell侵袭实验结果显示,si-NC+SAG组较si-NC+PBS组穿过基底胶(Matrigel)的细胞数量显著减少(均P<0.01)。而si-METTL14可以部分逆转SAG的上述对胃癌细胞的抑制作用。结论·SAG可以抑制胃癌细胞的增殖活性、克隆形成及侵袭潜能,这些作用可能是通过上调METTL14表达水平实现的。

麦角甾醇生物合成途径中的抗真菌药作用靶酶

麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组成成分 ,在真菌生活中起重要作用。一些不同类型的化合物通过作用于真菌麦角甾醇生物合成途径中不同环节的酶 ,干扰真菌麦角甾醇生物合成 ,发挥抗真菌作用。在麦角甾醇生物合成途径中 ,目前已知与抗真菌药作用有关的靶酶分别有羊毛甾醇 C- 14α去甲基化酶、角鲨烯环氧化酶、Δ7,8异构酶和Δ1 4 还原酶等 ,他们的结构和功能不同 。

胰腺癌组织中METTL14和GFPT1的水平表达与临床预后价值研究

目的研究胰腺癌组织中甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)及谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1(glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1,GFPT1)的表达及其临床意义。方法选取2017年4月~2019年4月上海交通大学附属第六人民医院诊治的86例胰腺癌患者为研究对象。利用实时定量PCR检测癌和癌旁组织中METTL14和GFPT1 mRNA水平表达。利用免疫组织化学检测癌和癌旁组织中METTL14和GFPT1蛋白表达。相关性分析采用Pearson相关分析及Spearman秩相关分析。比较不同胰腺癌患者METTL14和GFPT1蛋白表达与临床病理参数的关系。Kaplan-Meier生存分析胰腺癌组织中METTL14和GFPT1蛋白表达与患者生存预后的关系。单因素及多因素COX模型评价影响胰腺癌预后的因素。结果胰腺癌组织中METTL14 mRNA(5.442±0.437),GFPT1 mRNA(6.521±0.516)表达高于癌旁组织(0.992±0.203,0.895±0.212),差异具有统计学意义(t=85.644,93.525,均P<0.05)。胰腺癌组织中METTL14(73.26%),GFPT1(69.77%)蛋白表达阳性率高于癌旁组织(8.14%,9.30%),差异具有统计学意义(χ^(2)=75.545,65.765,均P<0.05)。胰腺癌组织中METTL14 mRNA与GFPT1 mRNA的表达呈明显正相关性(r=0.569,P<0.05);METTL14蛋白与GFPT1蛋白表达呈明显正相关性(r=0.664,P<0.05)。低分化程度(92.31%,88.46%)、AJCC分期Ⅱ~Ⅲ期(89.13%,86.96%)及有淋巴结转移(95.12%,92.68%)胰腺癌组织中METTL14,GFPT1蛋白表达阳性率分别高于高中分化程度(65.00%,61.67%)、AJCC分期Ⅰ期(55.00%,50.00%)及无淋巴结转移(53.33%,48.89%),差异具有统计学意义(χ^(2)=6.174~19.507,均P<0.05)。METTL14阳性表达组和GFPT1阳性表达组患者三年累积生存率分别低于METTL14阴性表达组,GFPT1阴性表达组(χ^(2)=15.232,18.054,均P<0.05)。肿瘤AJCC分期Ⅱ~Ⅲ期(OR=2.552,95%CI=1.420~4.455)、伴淋巴结转移(OR=1.754,95%CI=1.125~2.534)、METTL14阳性(OR=2.797,95%CI=1.233~5.876)、GFPT1阳性(OR=1.635,95%CI=1.030~2.506)是影响胰腺癌预后的独立危险因素。结论胰腺癌组织中METTL14,GFPT1表达升高,两者与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移有关,可用于评价胰腺癌患者生存预后。

暴马桑黄羊毛甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆、序列分析及原核表达

为深入了解暴马桑黄三萜合成途径的调控机理,基于前期测得的转录组数据,同时结合基因组数据(GenBank登录号为LNZH00000000.2),筛选得到暴马桑黄羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-demethylase,LSD)基因序列,并设计特异引物。以暴马桑黄菌丝体总RNA反转录得到的cDNA为模板,采用PCR技术克隆得到LSD基因cDNA序列全长,命名为SbLSD1(登录号为MN640689)。序列分析结果表明,SbLSD1基因cDNA序列全长1 746 bp,编码581个氨基酸,分子量为65.96 ku,没有信号肽,在53~75位氨基酸序列之间含有一个跨膜螺旋结构,属于P450超家族成员。系统发育分析表明,暴马桑黄LSD1蛋白和灵芝LSD蛋白同源性最高。将SbLSD1基因cDNA序列构建到原核表达载体pET-32a上,获得重组质粒pET-32a-SbLSD1,然后将其转入Escherichia coliBL21中进行SbLSD1蛋白诱导表达。SDS-PAGE结果显示,SbLSD1基因成功表达出蛋白,并在63~75 ku出现与预期大小一致的蛋白条带。通过对SbLSD1基因的克隆及表达分析,为进一步研究该基因在暴马桑黄三萜生物合成过程中的功能奠定基础。

METTL14介导ERα的m6A修饰调控子宫内膜癌转移的机制研究

背景与目的:甲基转移酶样因子14(methyltransferase-like factor 14,METTL14)失调引起的异常N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰在多种癌症的进展中发挥重要作用,目前尚不清楚其是否参与子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)的进展。本研究旨在探讨METTL14失调引起的异常m6A修饰在EC侵袭和转移中的作用。方法:收集96例2017—2021年在青海省人民医院接受治疗性手术的EC患者。从冷冻组织中分离RNA(70对)或蛋白质(10对),用于实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)或免疫印迹分析,以评估METTL14在EC中的表达。评估METTL14的表达及其与EC临床病理学特征的相关性。在体外和体内测定METTL14在EC中的生物学效应。将甲基化RNA免疫沉淀测序(methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq)与RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)相结合,并在m6A斑点印迹后,采用MeRIP-RTFQ-PCR、RIP-RTFQ-PCR或双荧光素酶报告基因分析来筛选和验证METTL14的候选靶标。结果:与匹配的相邻组织相比,EC中METTL14的mRNA表达和蛋白质水平显著下调。与METTL14高表达组相比,METTL14低表达组国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期、浸入深度、淋巴管血管侵犯、淋巴结转移及肿瘤转移例数显著增加(P<0.05)。在功能上,METTL14在体外和体内抑制EC细胞的增殖和侵袭能力。从机制上讲,METTL14介导的m6A去甲基化导致雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)转录后抑制。此外,与METTL14相比,ERα诱导肿瘤的致癌行为。结论:METTL14通过m6A依赖性方式在EC细胞中减弱ERα的表达,进而抑制肿瘤转移和侵袭。